Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Календарь

На основе статей спецпроекта мы решили сделать календарь «12 методов биологии» на 2019 год. Эта статья представляет апрель.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Варианты проведения реакции

Сегодня существуют десятки вариантов проведения ПЦР для разных целей, для повышения специфичности и эффективности. Разберем лишь несколько наиболее популярных и интересных.

ПЦР с горячим стартом

Известно, что Taq-полимераза может проявлять небольшую активность при комнатной температуре и даже когда пробирка с реакционной смесью находится во льду. Поэтому фермент всегда добавляют в смесь непосредственно перед запуском реакции. Но если, например, проб много, то какие-то из них некоторое время будут стоять уже с полимеразой, пока экспериментатор внесет ее во все пробирки. В этом случае есть вероятность получения неспецифически амплифицированных фрагментов.

Чтобы избежать такой неприятности, используют ПЦР с горячим стартом (hot start PCR), где в смесь добавляют полимеразу в комплексе с антителами, блокирующими ее активность. На первой стадии ПЦР (при 95 °С) антитела денатурируют, полимераза освобождается и только тогда начинает работу.

Ступенчатая ПЦР

При оптимальной температуре отжига праймеры иногда могут связываться и с не идеально комплементарными им участками, а вот если эту температуру немного повысить (например, до 72 °С), то специфичность гибридизации праймеров с матрицей можно существенно увеличить. На этом и основана ступенчатая ПЦР (touchdown PCR): первые циклы проводят при повышенной температуре отжига, постепенно снижая ее до оптимальной в следующих циклах. В результате поначалу вероятность неспецифичной амплификации снижается до минимума, а далее уже размноженные копии нужного фрагмента будут успешно конкурировать за праймеры с не полностью комплементарными им участками ДНК-матрицы.

«Холодная» ПЦР

COLD-PCR (CO-amplification at Lower Denaturation temperature-PCR) используют, когда необходимо выявить, например, однонуклеотидную мутацию гена, но при этом проба содержит ДНК-матрицу как с мутантным геном, так и с геном «дикого типа». Такая смесь типична для биоптатов или образцов крови онкологических больных, и потому этот анализ востребован в медицине для ранней диагностики рака или его рецидивов, а также для назначения индивидуальной терапии на основе молекулярного профилирования. Если делать стандартную ПЦР, то амплифицируются и мутантные, и немутантные аллели интересующего гена, причем последних будет значительно больше, и выявить мутацию будет очень трудно.

  • Стандартная денатурация при 94 °С.
  • Гибридизация при 70 °С, во время которой образуются гомодуплексы (обе цепи ДНК «дикого типа» или же обе мутантных, что маловероятно из-за их низкого содержания в исходной пробе) и гетеродуплексы целевых фрагментов (одна цепь «дикого типа», вторая — мутантная). В гетеродуплексе как минимум один нуклеотид (измененный) не может образовать водородных связей со своим «правильным» визави, что выражается в понижении температуры плавления такого дуплекса.
  • Критическая денатурация при Тс. Денатурируют лишь гетеродуплексы; гомодуплексы остаются в двухцепочечном состоянии.
  • Отжиг праймеров. Может идти только на разошедшихся цепях гетеродуплекса.
  • Элонгация.

После окончания всех циклов реакции полученные копии интересующего фрагмента секвенируют, чтобы точно установить место и тип мутации.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 15. Схема «холодной» ПЦР. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

ПЦР длинных фрагментов

Применяют, когда нужно амплифицировать очень длинные фрагменты — более 5 т. В long-range PCR часто используют две полимеразы: Taq и Pfu. Первая может за один проход синтезировать длинную цепь ДНК, но при этом «застревает», совершив ошибку, потому что не умеет вырезать только что вставленные нуклеотиды. Вторая полимераза менее процессивна, зато способна исправлять ошибки. Так они друг другу и помогают: Taq ошибается, а Pfu исправляет, давая возможность «подружке» закончить синтез.

Мультиплексная ПЦР

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 16. Результаты мультиплексной ПЦР ДНК пациента с миодистрофией Дюшенна. К дистрофии приводят различные мутации экзонов гена белка дистрофина. На дорожке 7 нет полосы, соответствующей экзону 48 (длиной 506 п. ) этого гена.

Однако при этом надо соблюдать такие условия:

  • температуры отжига праймеров не должны сильно разниться (то есть длина каждого праймера должна быть 18–28 нуклеотидов, а ГЦ-состав — 45–60%);
  • каждый набор праймеров должен давать фрагмент, отличный от других по размеру, чтобы после электрофореза в геле полосы не совпадали.

RAPD

Это ПЦР случайных полиморфных фрагментов ДНК — Random Amplification of Polymorphic DNA. К RAPD прибегают, когда нужно различить сходные геномы: виды бактерий, сорта растений, породы собак и т. Используют небольшой праймер (до 10 н. ), который может гибридизоваться со многими случайными участками генома. Если правильно подобрать последовательность праймера и условия реакции, то в геле после электрофореза пробы будут отличаться друг от друга количеством и (или) расположением полос.

Асимметричная ПЦР

Асимметричную реакцию (asymmetric PCR) проводят при желании получить амплифицированную копию участка только одной из цепей ДНК — например, для последующей гибридизации. В таком случае в реакционной смеси концентрация одного праймера должна быть намного выше, чем другого, и тогда на выходе будут превалировать фрагменты нужной цепи.

Метилспецифичная ПЦР

Геномная ДНК живых организмов, как правило, метилирована: после синтеза ДНК к небольшому проценту цитозинов и аденинов фермент ДНК-метилтрансфераза присоединяет метильную группу. Цели метилирования разнообразны: от регуляции экспрессии отдельных генов до регуляции целых процессов, таких как старение или канцерогенез.

Это свойство геномной ДНК эксплуатирует метилспецифичная ПЦР (methylation-specific PCR). Такой вариант ПЦР применяют, чтобы понять, метилирован ли определенный участок ДНК по цитозину.

Перед постановкой реакции ДНК-матрицу обрабатывают бисульфитом. Он преобразует неметилированные цитозины в урацилы, которые распознаются праймерами и полимеразой как тимины, а метилированные цитозины не трогает. Затем проводят две реакции с разными праймерами: в одну пробирку вносят праймеры, специфичные к последовательности с цитозинами, а в другую — к последовательности с урацилами. Если амплификация прошла в первой пробирке, значит ДНК на этом участке метилирована, если во второй — не метилирована.

ПЦР со вложенной парой праймеров

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 17. Схема вложенной ПЦР.

Инвертированная ПЦР

Этот вариант используют, когда известна последовательность (сиквенс) какого-то участка ДНК, но нужно амплифицировать вовсе не его, а то неизвестное, что его окружает. Например, необходимо узнать, в какое место генома встроился вирус с известным сиквенсом. Тогда-то и приходит на помощь инвертированная ПЦР (inverse PCR), которая состоит из нескольких этапов (рис. 18):

  • Ферментом лигазой полученные фрагменты закольцовывают.
  • Используя праймеры к известной последовательности, но ориентированные кнаружи от нее, амплифицируют ту самую, неизвестную, которую потом можно, например, секвенировать.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 18. Схема инвертированной ПЦР.

ПЦР с перекрывающимися праймерами

Чаще всего для соединения двух фрагментов двухцепочечной ДНК используют метод рестрикции/лигирования, когда края этих фрагментов разрезают одинаковыми эндонуклеазами с образованием «липких» концов, а потом соединяют их с помощью лигазы. Однако с этой целью можно применять и метод ПЦР.

ПЦР с перекрывающимися праймерами, или продлением перекрывания (overlap extension PCR), выполняется в несколько этапов (рис. 19):

  • Для каждого фрагмента ДНК-матрицы конструируют два праймера: один обычный, а второй (гибридизующийся со стороны будущей сшивки фрагментов) на 5ˊ-конце несет небольшую последовательность, соответствующую концу другого фрагмента, того, что будут пришивать.
  • Проводят две раздельные ПЦР — для каждого из фрагментов. В результате последовательность, содержащаяся на 5ˊ-концах «стыковочных» праймеров, уже входит в состав новообразованных амплифицированных фрагментов.
  • Содержимое обеих пробирок смешивают и используют уже только два праймера — для дальних (внешних) концов. Поскольку оба фрагмента содержат на одном конце последовательности, комплементарные друг другу, во время отжига праймеров фрагменты гибридизуются, а их перекрывающиеся 3ˊ-концы служат праймерами. Таким образом получаются длинные молекулы, состоящие из двух фрагментов.

Этот же вариант ПЦР, но с небольшими модификациями, используют и для внесения мутаций, например, если из длинного фрагмента ДНК надо удалить какой-то участок.

Рисунок 19. Схема ПЦР с перекрывающимися праймерами.

Сборочная ПЦР

Этот вариант похож на предыдущий. Его используют для сборки синтетических молекул ДНК из отдельных фрагментов, например, чтобы получить синтетические гены или даже целые геномы.

В сборочной ПЦР (assembly PCR) используют одноцепочечные олигонуклеотиды длиной до 50 н. , одна часть которых предназначена для образования одной цепи ДНК, а другая — для образования другой (рис. 20). Важно, чтобы эти олигонуклеотиды частично перекрывались концами (примерно на 20 нуклеотидов) с «соседями» на будущей противоположной цепи, поскольку они сами будут работать и праймерами, и матрицей. Во время первых 30 циклов ПЦР концы олигонуклеотидов удлиняются по матрице фрагментов противоположной цепи. К концу процесса каждый олигонуклеотид удлинится настолько, что превратится в отдельную цепочку будущей синтетической ДНК. Тогда в реакцию добавляют пару праймеров, комплементарных концам этой ДНК, и проводят дополнительные 23 цикла, получая на выходе множество копий синтетической ДНК.

Рисунок 20. Схема сборочной ПЦР.

Рисунок 21. Схема твердофазной ПЦР.

Твердофазная ПЦР

Это реакция, которую проводят непосредственно в клетках или тканях, например, для изучения внутриклеточного развития вирусов. Сначала клетки или ткань фиксируют на предметном стекле и обрабатывают протеазой, чтобы расщепить белки и освободить ДНК (или РНК, если собираются проводить ОТ-ПЦР). Затем прямо на стекло добавляют смесь для ПЦР и ставят препарат в амплификатор. Выявляют получившиеся фрагменты либо ДНК-гибридизацией, либо иммунологическими методами.

Капельная цифровая ПЦР

Цифровая ПЦР (digital PCR) — более точный и воспроизводимый метод количественного определения ДНК, чем ПЦР в реальном времени. Стандартная ПЦР проходит во всём объеме образца, а при цифровой пробу делят на большое количество маленьких субъединиц (компартментов) и проводят ПЦР в каждой из них отдельно. Методы разделения на компартменты в различных технологиях цифровой ПЦР отличаются друг от друга (используют масляную эмульсию, капилляры и т. ), а реакцию проводят в планшетах с микролунками. Результаты визуализируют чаще всего с помощью системы TaqMan, но иногда применяют и интеркалирующие агенты, например, зеленую флуоресцирующую краску EvaGreen.

В ddPCR из 20 мкл образца, в котором требуется определить количество исследуемой ДНК, создают водно-маслянную эмульсию. Реакционную смесь разделяют на приблизительно 20 000 капель-реакций объемом около 1 нл каждая с помощью автоматического генератора капель (рис. 22). При этом генетический материал распределяется по каплям случайным образом: в них попадают как ДНК-мишени, так и фоновая ДНК. Процесс распределения целевой ДНК по каплям чисто случайный и подчиняется закону распределения малых чисел Пуассона. Перед разделением образца на капли не обязательно разводить его до концентрации, чтобы в каждой капле было либо 0, либо 1 копия ДНК-мишени: при анализе результатов учитываются ситуации, когда в одной капле находится более одной копии мишени.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 22. Схема цифровой ПЦР с использованием системы QX200™ от Bio-Rad.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 23. Автоматическая шприц-пипетка ридера капель извлекает капли из каждой лунки планшета для ПЦР.

В кцПЦР определение количества ДНК-мишени проводят не относительно, используя калибровочную кривую, как в случае с ПЦР в реальном времени, а прямым подсчетом капель с наличием или отсутствием в них ДНК-мишени. Это существенно увеличивает стабильность системы и ее устойчивость к ингибиторам ПЦР.

При наличии только двух флуоресцентных каналов (FAM и HEX/VIC) система позволяет запускать 4–5-плексные реакции за счет использования смеси зондов с одной нуклеотидной последовательностью, но меченных красителями FAM и HEX/VIC в различных пропорциях. Возможно также проводить 2–3-плексные реакции с интеркалирующим красителем EvaGreen, используя различную «емкость» разноразмерных ПЦР-продуктов для интеркалятора, что позволяет независимо подсчитать количество этих продуктов по разнице уровня их флуоресценции.

С помощью капельной цифровой ПЦР можно определять:

  • количество интересующих молекул ДНК в образце;
  • до 0,01% минорного, например мутантного, генома в присутствии генома нормальной ткани;
  • вариации числа копий гена (copy namber variation, CNV);
  • уровень экспрессии генов и микроРНК, включая детекцию небольших (до 10%) изменений уровня экспрессии;
  • различия в геномном контенте и экспрессии между единичными клетками.

Метод активно используют в различных областях, но наиболее часто при:

  • проведении онкоисследований, включая анализ свободной циркулирующей ДНК и образцов жидкой биопсии (EGFR, BRAF, KRAS и т.д.);
  • детекции нужных вариантов в экспериментах по геномному редактированию (CRISPR/Cas9, ZFN, TALEN);
  • изучении геномики единичных клеток (single cell).

Несмотря на сходство применения цифровой ПЦР и ПЦР в реальном времени, скорее всего, в будущем ddPCR будет постепенно вытеснять real-time PCR как основной ПЦР-метод количественного определения ДНК.

ПЦР, количественная ПЦР, цифровая ПЦР

Специфичность ПЦР зависит от гибридизации с матрицей коротких последовательностей — праймеров, — которые комплементарны участкам, фланкирующим (ограничивающим) последовательность-мишень, а чувствительность — от природы фермента ДНК-полимеразы. ПЦР обычно состоит из серии температурных циклов, повторяющихся 20–40 раз. Каждый цикл — это последовательные денатурация двухцепочечной ДНК, гибридизация праймеров с ДНК-матрицей и элонгация (удлинение этих праймеров ДНК-полимеразой) (рис. 1а). Таким образом в каждом цикле количество молекул ДНК-мишени удваивается (так называемая экспоненциальная амплификация), и теоретически после n циклов может быть получено 2n копий. На практике амплификация насыщается и выходит на плато по мере того, как реагенты ПЦР истощаются, а накопленные продукты ПЦР «отжигаются» сами на себя, предотвращая дальнейшую амплификацию. Наличие и примерное количество («много—мало») ПЦР-продукта можно оценить при помощи гель-электрофореза.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 1а. Принципы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Каждый цикл ПЦР включает три этапа: (1) денатурация двухцепочечной ДНК нагреванием; (2) отжиг праймеров с комплементарными последовательностями ДНК-мишеней; (3) удлинение праймеров термостабильной ДНК-полимеразой. Типичная реакция ПЦР повторяется 20–40 раз.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 1б. График амплификации ПЦР в реальном времени в линейной шкале. Типичный такой график — кривая сигмоидальной формы с четырьмя отдельными фазами:

  • В ранних циклах ПЦР сигнал флуоресценции продукта амплификации остается на уровне фона. Пороговая линия устанавливается для устранения фонового флуоресцентного сигнала.
  • Во время экспоненциальной фазы количество продукта ПЦР удваивается с каждым циклом при идеальных условиях реакции, то есть при эффективности амплификации 100%. Цикл количественного определения (Cq) — это номер цикла, при котором график амплификации пересекает пороговую линию, установленную значительно выше базовой линии.
  • Линейная фаза указывает на то, что реагенты истощаются, что приводит к снижению эффективности амплификации. Сигнал усиления теряет экспоненциальность.
  • Фаза плато указывает на насыщение сигнала. Реагенты исчерпаны, и дополнительный продукт ПЦР не образуется или не обнаруживается.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 2. Анализ количественной ПЦР в реальном времени с использованием стандартной кривой. а — Кривые амплификации для шеститочечной серии десятикратных разведений матрицы с известными концентрациями (стандарт — образец с известной концентрацией, используемый для построения стандартной кривой) более пяти порядков (например, геномная ДНК, ампликон ПЦР, линеаризованная плазмида). Определяют значение Cq каждого серийно разбавленного стандарта. Кривые от коричневого до розового цветов — стандартные кривые различных разведений. Синяя и зеленые кривые — кривые амплификации образцов. б — Стандартная кривая создается путем нанесения значений Cq, полученных из кривых амплификации серии разведений, в зависимости от логарифма стандартного количества. По ней можно определить количество исследуемого образца, нанеся его значение Cq на график. Наклон стандартной кривой измеряет эффективность амплификации количественной ПЦР. Наклон −3,32 (для стандартной кривой, полученной из серии десятикратных разведений) указывает на 100%-эффективность амплификации (количество продукта ПЦР удваивается во время каждого цикла).

Ct (cycle threshold) — это количество циклов создания дополнительных копий РНК, начиная с которого результат конкретного теста считается положительным. — Ред.

Короткая одноцепочечная последовательность ДНК, имеющая флуорофор и «гаситель» на 3′- и 5′-концах, комплементарна внутреннему участку ДНК-мишени. При гибридизации с ДНК-мишенью зонд не флуоресцирует, при прохождении полимеразы во время элонгации зонд гидролизуется за счет 5′–3′ экзонуклеазной активности Taq-полимеразы, метки оказываются в растворе сильно разнесенными, и флуорофор начинает работать.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 3. Принципы цифровой ПЦР. Образец разведен и наносится во множество независимых ячеек (или капель). Каждая ячейка действует как отдельный микрореактор ПЦР, и ячейки, содержащие амплифицированные ДНК-мишени, обнаруживаются по флуоресценции. Распределение ДНК-мишеней в ячейках можно аппроксимировать распределением Пуассона. Отношение положительных сигналов (наличие флуоресценции) к общему количеству позволяет определить концентрацию мишени в образце.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 4. Сравнение методов на основе ПЦР

Таблица 1. Сходства и различия цПЦР и кПЦР.

кПЦРцПЦР

Различия
Требуется стандартная криваяСтандартная кривая не требуется
Нет разделения образцаОбразец разделен на множество ячеек
Данные собираются в режиме реального времениСбор данных в конечной точке после окончания реакции
Относительная количественная оценкаАбсолютная количественная оценка
Сходства
Совместимость методов пробоподготовки
Компоненты реакции амплификации и их концентрации одинаковые — PCR Master Mix, флуоресцентные зонды, праймеры, ДНК-матрица
Служат для определения количеств мишени, присутствующей в образце
Одинаковые начальные объемы образца
Оба работают либо с гидролизными зондами (TaqMan Probes, Molecular Beacons, Hybridization Probes, Scorpions Probes etc. ), либо с ДНК-связывающим красителем (SYBR Green I, YO-PRO-1, SYBR® Gold, SYTO, BEBO, BOXTO и EvaGreen)
Широкий динамический диапазон
Возможность мультиплексирования

Требуется стандартная криваяСтандартная кривая не требуетсяНет разделения образцаОбразец разделен на множество ячеекДанные собираются в режиме реального времениСбор данных в конечной точке после окончания реакцииОтносительная количественная оценкаАбсолютная количественная оценка

12 биологических методов в картинках

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Генеральный партнер цикла — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Партнер этой статьи — «СкайДжин»

Пять причин выбрать SkyGen:

  • Доступ к высококачественной продукции для молекулярной биологии
  • Быстрая логистика и складская программа
  • Удобное и взаимовыгодное сотрудничество
  • Высококвалифицированная поддержка
  • Адекватные цены

Одна из главных миссий «Биомолекулы» — докопаться до самых корней. Мы не просто рассказываем, какие новые факты обнаружили исследователи — мы говорим о том, как они их обнаружили, стараемся объяснить принципы биологических методик. Как вытащить ген из одного организма и вставить в другой? Как проследить в огромной клетке за судьбой нескольких крошечных молекул? Как возбудить одну крохотную группу нейронов в огромном мозге?

И вот мы решили рассказать о лабораторных методах более системно, собрать воедино в одной рубрике самые главные, самые современные биологические методики. Чтоб было интереснее и нагляднее, мы густо проиллюстрировали статьи и даже кое-где добавили анимации. Мы хотим, чтобы статьи новой рубрики были интересны и понятны даже случайному прохожему. И с другой стороны — чтобы они были так подробны, что даже профессионал мог бы обнаружить в них что-то новое. Мы собрали методики в 12 больших групп и собираемся сделать на их основе биометодический календарь. Ждите обновлений!

Использование секвенирования нового поколения

Производительность и относительная доступность NGS-методов привели к настоящей революции в биологической и медицинской науке. Более того, благодаря новым подходам появилась реальная возможность проводить ранее технически недоступные исследования. Использование секвенирования нового поколения позволяет проводить такие проекты как:

  • Полногеномный анализ (в том числе, ресеквенирование и секвенирование de novo). Ресеквенирование полных геномов человека в интересах персонализированной медицины или секвенирование ранее не изученных геномов вирусов, бактерий, архей, растений, грибов и животных как с чисто фундаментальными, так и прикладными целями.
  • Секвенирование РНК (RNA-Seq), позволяющее оценивать экспрессию генов не только качественно, но и количественно. Существует возможность отдельно оценивать экспрессию кодирующих и регуляторных РНК. Данные методики направлены на изучение работы генома (активности его генов, в том числе генов-регуляторов) в разных клетках, тканях и органах.
  • Метагеномное секвенирование — оценка разнообразия микроорганизмов в различных образцах. Позволяет оценивать бактериальное разнообразие в различных средах, например, в кишечнике человека, донных отложениях озера Байкал или в горячих источниках Камчатки.
  • Анализ ДНК-белковых взаимодействий (ChIP-Seq) — изучение влияния транскрипционных факторов и других ДНК-связывающих белков на экспрессию генов, а через нее на фенотипические и физиологические особенности клеток, органов и тканей.
  • Бисульфитное секвенирование и его модификации (например, RRBS) — оценка метилирования в геноме или его участках. Влияние метилирования регуляторных участков генома на уровень экспрессии генов через подавление их транскрипционной активности.
  • Таргетное секвенирование (экзомное секвенирование, секвенирование митохондриальных генов, секвенирование ампликонов). Секвенирование отдельных (выбранных исследователем) участков генома, например, только генов митохондриальной ДНК, кодирующих белки генов или генов, для которых уже описано участие в процессах онкогенеза. Таргетное секвенирование позволяет значительно снизить стоимость эксперимента (из расчета на один образец) и многократно увеличить количество анализируемых образцов.

Принцип метода

Все мы знаем, что ДНК — это двухцепочечная молекула, где каждая цепочка состоит из звеньев-нуклеотидов. Нуклеотиды составлены из трех молекул: остатка фосфорной кислоты, сахара и азотистого основания. Если сахар и фосфат одинаковы у всех нуклеотидов в ДНК (в РНК сахар другой), то азотистых оснований четыре (если не считать редкие модификации): аденин, тимин, цитозин и гуанин, обозначаемые А, Т, Ц и Г соответственно. В молекулах РНК тимин заменен урацилом. Нуклеотиды соединяются в цепочку, образуя связи между фосфатной группой одного нуклеотида и гидроксильной — другого. В результате на одном конце каждой цепи ДНК «висит» фосфатная группа (5ˊ-конец), а на другом — гидроксильная (3ˊ-конец). Две цепи нуклеотидов расположены в молекуле ДНК антипараллельно, то есть напротив 3ˊ-конца одной находится 5ˊ-конец другой. Чтобы молекула была стабильной, цепочки должны как-то взаимодействовать друг с другом. Это обеспечивают водородные связи, образующиеся между азотистыми основаниями противоположных цепей по принципу комплементарности: А соединяется только с Т (или У в РНК), а Г — с Ц (рис. 5, видео 2). И поэтому, имея одну цепь ДНК, в соответствии с этим правилом легко построить ее пару. Собственно, на этом и основана ПЦР.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 5. Строение ДНК.

Видео 2. Строение ДНК.

Типичная реакционная смесь

  • Анализируемая ДНК. Это может быть как отдельный кусочек молекулы, так и плазмида, хромосома или геном клетки полностью. Для грубой оценки сойдет даже суспензия клеток. ДНК служит матрицей для многократного копирования нужного участка.
  • Праймеры.Праймер — это искусственно синтезированная короткая цепочка нуклеотидов (15–30 штук), комплементарная выбранному участку одной из цепей анализируемой ДНК. Один из праймеров обычно соответствует началу амплифицируемого отрезка, другой — его концу, но на противоположной цепи. У праймеров, как и у любого олиго- или полинуклеотида, есть 3ˊ- и 5ˊ-концы.
  • Нуклеотиды. А точнее, дезоксинуклеотидтрифосфаты — четыре вида «кирпичиков» для строительства цепей ДНК: дАТФ, дТТФ, дЦТФ и дГТФ.
  • ДНК-полимераза. Фермент, строящий комплементарную матричной цепь ДНК. Он может начинать синтез только от 3ˊ-конца праймера. Обычно используют термостабильные полимеразы, изначально выделенные из термофильных бактерий и архей: Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза) и Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза). Первая — самая производительная, а две другие — более точные.
  • Буфер. Раствор, содержащий различные ионы для поддержания нужного рН, соли магния, необходимые для работы полимеразы, и неионный детергент Tween-20 в сочетании с BSA (бычьим сывороточным альбумином) для предотвращения налипания компонентов реакции на стенки пробирки. В случае ГЦ-богатых матриц в смесь часто добавляют энхансер — ДМСО (диметилсульфоксид), предотвращающий нежелательные взаимодействия между комплементарными участками матрицы.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 6. Состав смеси для ПЦР.

Все компоненты смешивают в нужном объеме деионизованной воды в специальных пробирках для ПЦР и помещают в амплификатор (или ПЦР-циклер) (рис. 7, видео 3).

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 7. Расходные материалы и оборудование для ПЦР. а — ПЦР-пробирки. б — Амплификатор C1000 Touch™ производства Bio-Rad.

Видео 3. Приготовление смеси для ПЦР.

Секвенирование по Сэнгеру

Один из наиболее популярных методов секвенирования обязан своим появлением английскому биофизику Фредерику Сэнгеру (1918–2013) — единственному ученому в истории мировой науки, получившему сразу две Нобелевские премии по химии (в 1958 и 1980 годах). Первую премию присудили за установление структур белков, особенно инсулина, а вторую награду ему вручили в том числе и за разработку методов определения первичной последовательности нуклеиновых кислот.

Методику секвенирования ДНК с использованием радиоактивно меченых нуклеотидов и ДНК-полимеразы (или фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I) предложили Сэнгер и его коллеги в 1977 году, причем с течением времени этот метод прошел несколько модификаций и к настоящему моменту считается золотым стандартом современного секвенирования.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 4. «Плюс-минус» метод секвенирования ДНК, предложенный Ф. Сэнгером и А. Коулсоном.

Секвенирование ДНК по Сэнгеру

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Рисунок 5. Метод «терминаторов»: используют ДНК-полимеразу, олигонуклеотидные праймеры и смесь четырех дезоксинуклеотидов (dNTPs) (А, Т, G и C), один из которых радиоактивно помечен по α-положению фосфата (32P). В каждую из четырех реакций добавляется по одному 2’,3’-дидезоксинуклеозидтрифосфату (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), которые терминируют дальнейшую реакцию (синтез комплементарной молекулы ДНК с матрицы) — таким образом в каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом. Затем полученные фрагменты визуализируют с помощью электрофореза и, сравнивая длины фрагментов из четырех реакций с ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP, восстанавливают последовательность ДНК.

Автоматизированные модификации метода «терминаторов» активно применяют до сих пор в специальных приборах — секвенаторах. Открытие многочисленных флуоресцентных молекул позволило отказаться от использования радиоактивной метки и сделало возможным проведение реакции в одной пробирке. Реакционную смесь разделяют капиллярным электрофорезом, a выстроившиеся в синтезируемую цепочку ДНК меченые нуклеотиды затем регистрируют детекторами флуоресценции, предоставляя возможность считывать последовательность всего секвенируемого ДНК-фрагмента.

Другие методы секвенирования «старого поколения»

Секвенирование по Сэнгеру позволяет «считывать» последовательности до 1000 пар нуклеотидов и применяется для небольших фрагментов генома/генов. В частности, оно используется для:

  • секвенирования отдельных участков генома с целью анализа мутаций и полиморфизмов;
  • идентификации вирусов и организмов (бактерий, растений, грибов и животных);
  • валидации данных, полученных на платформах секвенирования нового поколения (NGS);
  • микросателлитного анализа;
  • анализа делеций и инсерций (малых и протяженных).

Наиболее популярными секвенаторами, использующими технологию секвенирования по Сэнгеру, являются приборы, производимые компанией Thermo Fisher Scientific: 3730xL, 3730, 3500xL, 3500, 3130xL, 3130, 310.

Следует отметить, что все описанные выше типы исследований сейчас можно проводить с помощью секвенирования «нового поколения», речь о котором пойдет в следующей главе, однако главные плюсы секвенирования по Сэнгеру — высокая точность (достоверность) полученных данных и невысокая стоимость работ при анализе небольшого количества ДНК-фрагментов — сохраняют актуальность этого типа определения последовательности НК.

Методы амплификации нуклеиновых кислот в диагностике инфекционных заболеваний ответы нмо с ответами

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!:

Adblock
detector