ПЦР ЛАБОРАТОРИЯ ТРЕБОВАНИЯ К ПОМЕЩЕНИЮ 3 4 ГР ПАТОГЕННОСТИ

ПЦР ЛАБОРАТОРИЯ ТРЕБОВАНИЯ К ПОМЕЩЕНИЮ 3 4 ГР ПАТОГЕННОСТИ


ПЦР ЛАБОРАТОРИЯ ТРЕБОВАНИЯ К ПОМЕЩЕНИЮ 3 4 ГР ПАТОГЕННОСТИ

Сейчас практически все пациенты и медицинский персонал должны обследоваться на COVID-19, при этом важно отличить коронавирусное поражение от других инфекционных и неинфекционных болезней. Поэтому значение ПЦР-метода возросло, ведь такие исследования являются золотым стандартом диагностики многих инфекционных заболеваний. Это один из самых быстрых, специфичных и чувствительных способов выявить этиологический агент инфекции, а значит, и возможность вовремя назначить подходящее лечение пациенту.

В статье мы подскажем, как организовать ПЦР-лабораторию и безопасно проводить ПЦР-диагностику на ее базе. Вы узнаете, какие требования предъявляются к таким лабораториям, что вам нужно обязательно предусмотреть при их проектировании и открытии, получите пакет необходимых документов.

Лучше всего размещать ПЦР-лабораторию в отдельно стоящем корпусе или части здания, изолированной от других подразделений медицинской организации.

Если соблюсти такие условия невозможно, то на базе уже действующей лаборатории выделите специальный блок для ПЦР-исследований. При этом в блоке организуйте самостоятельные рабочие зоны, которые соответствуют:

КАКИЕ РАБОЧИЕ ЗОНЫ ДОЛЖНЫ БЫТЬ В ПЦР-ЛАБОРАТОРИИ?

Все помещения для ПЦР-диагностики должны быть боксированными, промаркируйте и пронумеруйте их в соответствии с этапами исследований.

В ПЦР-лаборатории выделите «заразную» и «чистую» зоны.

Требования к отделке помещений

Для ПЦР-лаборатории выбирайте отделочные материалы, мебель и оборудование, устойчивые к мытью, обработке дезинфицирующими средствами и ультрафиолетовым облучением.

Для стен и пола используйте кафельную плитку (предпочтительно).

Все поверхности должны быть гладкими, без трещин или щелей.

На окна поставьте надежные запирающие устройства. Можете использовать светозащитные пленки из материалов, устойчивых к дезинфектантам.

Устанавливать жалюзи нельзя — они адсорбируют пыль.

Каждое рабочее помещение оборудуйте водопроводом, канализацией, электричеством, отоплением, средствами пожаротушения, естественным и искусственным освещением, а также приточно-вытяжной вентиляцией.

Требования к оборудованию

Проверьте себя по чек-листу.


ПЦР ЛАБОРАТОРИЯ ТРЕБОВАНИЯ К ПОМЕЩЕНИЮ 3 4 ГР ПАТОГЕННОСТИ

Требования к вентиляции и обеззараживанию воздуха

Требования к вентиляции представлены на схеме 2. Допустима установка кондиционеров, но при условии их выключения на время проведения работ с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот и последующей дезинфекции рабочих мест, ежемесячной дезинфекции оборудования и замены фильтров.


ПЦР ЛАБОРАТОРИЯ ТРЕБОВАНИЯ К ПОМЕЩЕНИЮ 3 4 ГР ПАТОГЕННОСТИ

Требования к боксам биологической безопасности


ПЦР ЛАБОРАТОРИЯ ТРЕБОВАНИЯ К ПОМЕЩЕНИЮ 3 4 ГР ПАТОГЕННОСТИ

Различают боксы трех классов (см. схему 3).


ПЦР ЛАБОРАТОРИЯ ТРЕБОВАНИЯ К ПОМЕЩЕНИЮ 3 4 ГР ПАТОГЕННОСТИ

ПЦР ЛАБОРАТОРИЯ ТРЕБОВАНИЯ К ПОМЕЩЕНИЮ 3 4 ГР ПАТОГЕННОСТИ

В рабочих зонах 1 и 2 все манипуляции с материалами, которые могут содержать ПБА, включая процедуры с риском образования аэрозолей, выполняйте в боксах биологической безопасности классов II или III.

В зонах 3, 4-1 и 4-2 используйте боксы биологической безопасности классов I и II либо ПЦР-боксы.

При работе с материалом, содержащим микроорганизмы III-IV групп патогенности, этапы анализа, выполняемые в рабочих зонах 4-1 и 4-2, проводите на лабораторных столах.


ПЦР ЛАБОРАТОРИЯ ТРЕБОВАНИЯ К ПОМЕЩЕНИЮ 3 4 ГР ПАТОГЕННОСТИ

Е. В. Дубель, кандидат медицинских наук, врач-эпидемиолог, врач-дезинфектолог,
И. А. Лебедева, заведующий КДЛ БУЗ ВО «Вологодский противотуберкулезный диспансер»

Материал публикуется частично. Полностью его можно прочитать в журнале «Санэпидконтроль. Охрана труда» № 6, 2020.

Организация работы
при исследованиях методом ПЦР материала,
инфицированного патогенными
биологическими агентами
III — IV групп патогенности

. Разработаны: Федеральным Центром госсанэпиднадзора
Минздрава России (Е. Н. Беляев, И. В. Брагина, С. Г. Домнин, М. В. Зароченцев, Э. Ф.
Опочинский, Т. В. Воронцова); Центром по генной диагностике особо опасных
инфекционных заболеваний Минздрава России на базе Российского
научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (А. Н. Куличенко,
Н. А. Осина, И. Н. Шарова, М. Н. Ляпин, И. Г. Дроздов, В. В. Кутырев); Противочумным
центром Минздрава России (В. Е. Безсмертный, С. М. Иванова, Ю. А. Панин); ООО
«Биоком» (А. В. Сычев, А. Б. Комаров, Л. А. Сердобинский).

. Утверждены и введены в действие Главным
государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем
Министра здравоохранения Российской Федерации Г. Г. Онищенко 4 марта 2004 г.

. С введением настоящих методических указаний теряют
силу «Методические рекомендации по проведению работ в диагностических
лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные
положения», утвержденные заместителем Председателя госкомсанэпиднадзора Г. Г.
Онищенко 22.06.95.

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра

Дата введения: с момента утверждения

Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала,
инфицированного патогенными биологическими агентами IIIIV групп патогенности

. Настоящие методические указания устанавливают требования
к помещениям лабораторий и порядку проведения в них работ с патогенными
биологическими агентами (ПБА) III — IV групп патогенности с использованием методов,
основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

. Методические указания регламентируют выполнение
исследований методом ПЦР с применением оборудования и тест-систем, разрешенных
к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке.

. Методические указания определяют принципы
организации работы лабораторий, использующих метод полимеразной цепной реакции,
на этапах выполнения ПЦР-анализа.

Нормативные ссылки

. С П 1.2.731-99 «Безопасность работы с
микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами». Минздрав России,
1999.

. С П 1.2.1318-03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического
заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных
заболеваний человека I — IV групп патогенности (опасности),
генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического
происхождения и гельминтами». Минздрав России, 2003.

. С П 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и
транспортирования микроорганизмов — IV групп
патогенности». Госкомсанэпиднадзор России, 1995.

«Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного
микроорганизмами I — II групп патогенности». Минздрав России, 2003.

. М У 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого
материала, инфицированного бактериями — IV групп
патогенности при работе методом ПЦР». Минздрав России, 2001.

. « Методические указания по применению бактерицидных
ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях» № 11-16/03-06 от
28.02.95. Минздравмедпром России, 1995.

Общие положения

. Полимеразная цепная реакция представляет собой
процесс многократного увеличения числа копий (амплификация) фрагмента ДНК-мишени
(кДНК), катализируемый in
vitro термостабильной ДНК-полимеразой, и
позволяет обнаружить специфичный участок генома биологического агента.

. П ЦР обладает высокой чувствительностью,
специфичностью, обеспечивает возможность работы практически с любым видом
биологического материала и объектами окружающей среды, позволяет выполнять
анализ в течение 4 — 8 ч. Аналитическая чувствительность тест-систем для
выявления ДНК (РНК) микроорганизмов методом ПЦР составляет 1102 — 1104
м.к. (геномэквивалент/мл), специфичность — 85 — 100 %.

. По результатам анализа выдают предварительный ответ
о наличии в пробе специфических участков (фрагментов) ДНК или РНК, имеющих
гомологию с определенным участком генома возбудителя того или иного
инфекционного заболевания, а также о наличии в исследуемом материале
генетических маркеров или генетически модифицированных ДНК.

. Проведение исследований методом ПЦР сопряжено с
необходимостью обеспечения соблюдения правил биологической безопасности, а
также определенных требований к организации и проведению анализа с целью
предотвращения контаминации исследуемых проб нуклеиновыми кислотами и получения
ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Требования к организации работы с ПБА III — IV групп патогенности методом ПЦР

. Общие требования

. Работу с ПБА III — IV
групп патогенности методом ПЦР проводят только при наличии в организации
лицензии на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных
заболеваний человека, и санитарно-эпидемиологического заключения о возможности
проведения соответствующих работ в лаборатории, выданных в установленном
порядке.

. Организацию работ на этапах приема, разбора и
первичной обработки материала, подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот,
а также обеззараживания проб проводят в соответствии с требованиями СП
1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV
групп патогенности и гельминтами». Работу на остальных этапах ПЦР-анализа
проводят, как с обеззараженным материалом.

. В лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое
заключение о возможности проведения работ с ПБА III группы
патогенности, допускается проведение исследований методом ПЦР (без
предварительного накопления возбудителя) с целью диагностики бруцеллеза,
парентеральных вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции, возбудители которых относятся
ко II группе патогенности.

. Требования к помещениям ПЦР-лаборатории

. Помещения ПЦР-лаборатории, проводящей работы с ПБА III —
IV групп патогенности, должны соответствовать
требованиям СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III —
IV групп патогенности и гельминтами».

. Проведение исследований методом ПЦР с ПБА III —
IV группы патогенности допускается на базе действующих
микробиологических (бактериологических, вирусологических, иммунологических и
др.) лабораторий при условии соблюдения требований СП 1.2.731-99 «Безопасность
работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами» и организации в
лаборатории самостоятельных или выделенных в составе других функциональных
помещений рабочих зон, соответствующих этапам ПЦР-анализа.

. П ЦР-лаборатория должна включать следующий
минимальный набор рабочих зон:

• приема, регистрации, разбора и первичной обработки
материала;

• выделения НК;

• приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР;

• детекции продуктов амплификации методом
электрофореза или ГиФА.

. В ПЦР-лабораториях необходимо также предусмотреть
наличие вспомогательных помещений: комнаты ведения учетных документов или
ординаторской (комнаты персонала)*; кабинета заведующего
лабораторией*; раздевалки для сотрудников**; комнаты
приема пищи**; туалета**; подсобных (складских) помещений**.

*
Помещения могут быть объединены.

** Помещения могут быть общими с другими подразделениями
учреждения.

. Необходимо наличие автоклавной комнаты для
обеззараживания исследуемого материала. Она может быть общей с другими
подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической
безопасности.

. Помещения для выполнения работ на этапах ПЦР-анализа
должны быть боксированными (боксы с предбоксами).

. В зоне приема, регистрации, разбора и первичной
обработки материала проводят прием ПБА, пробоподготовку (сортировку,
маркировку, центрифугирование и др.), хранение и первичную инактивацию остатков
биоматериала дезинфицирующими средствами. Зону приема, регистрации, разбора и
первичной обработки материала располагают в комнате приема материала или в
отдельном боксированном помещении. Здесь же можно проводить прием и обработку проб
для исследования другими методами (бактериологическими, вирусологическими,
иммунологическими и т.д.), при условии выделения отдельного оборудованного
рабочего места для ПЦР-анализа.

. Зону выделения нуклеиновых кислот размещают в
отдельном помещении. При организации ПЦР-лаборатории на базе действующей
микробиологической лаборатории допускается выделение НК в помещениях, в которых
проводят другие виды исследований, кроме генно-инженерных работ и работ по
накоплению ПБА. В этом случае в помещении организуют рабочую зону для выделения
нуклеиновых кислот (НК), в которой располагают ПЦР-бокс или бокс биологической
безопасности. В ПЦР-боксе (или боксе биологической безопасности) для выделения
НК не допускается проведение других работ.

. В зоне приготовления реакционных смесей и проведения
ПЦР производят приготовление ПЦР-смеси, внесение в пробирку для ПЦР выделенных
препаратов ДНК или кДНК, обратную транскрипцию РНК и амплификацию ДНК или кДНК.
Помещение для приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР должно быть
отдельным. Приготовление реакционных ПЦР-смесей проводят в ПЦР-боксе.

. При необходимости этап выделения НК может быть
совмещен в одном помещении с этапом приготовления реакционных смесей и
проведения ПЦР при наличии в нем отдельных ПЦР-боксов (боксов биологической
безопасности) — для подготовки реакционных ПЦР-смесей и для выделения НК.

. Зону детекции продуктов амплификации располагают в
отдельном помещении, по возможности оснащенном ПЦР-боксом.

. При необходимости одновременного использования для
детекции продуктов амплификации метода электрофореза и метода гибридизационного
анализа следует выделить в помещении детекции отдельную рабочую зону для
проведения гибридизационного анализа. В этом случае оборудование и принадлежности
для каждого вида детекции маркируют применительно к каждой зоне. Не допускается
использовать для проведения гибридизационного анализа пипетки и посуду,
предназначенные для электрофореза.

. Планировочные решения и размещение оборудования должны
обеспечивать поточность движения исследуемого материала. Следует полностью
исключить воздухообмен между помещением детекции продуктов амплификации и
другими помещениями.

. Лабораторию оборудуют водопроводом, канализацией,
электричеством и отоплением в соответствии с СП 1.2.731-99 «Безопасность работы
с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами». Все помещения
лаборатории обеспечивают достаточным естественным и искусственным освещением.

. При строительстве новых или реконструкции имеющихся
ПЦР-лабораторий помещения оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией.
Разница в давлении воздуха в помещениях ПЦР-лаборатории достигается за счет
различий в кратности воздухообмена в них. Кратность воздухообмена должна
соответствовать значениям, приведенным в таблице.

. При необходимости в ПЦР-лаборатории могут быть
установлены кондиционеры в соответствии с СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с
микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».

. Внутреннюю отделку помещений выполняют в
соответствии с их функциональным назначением. Поверхности стен, пола и потолка
в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко
обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы
не должны быть скользкими.

. Лабораторная мебель должна иметь покрытие,
устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств. Поверхность столов не
должна иметь трещин и швов.

. Помещения на всех этапах ПЦР-анализа оборудуют
бактерицидными лампами в соответствии с «Методическими указаниями по применению
бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях» №
11-16/03-06 от 28.02.95. Бактерицидные лампы в помещениях ПЦР-лаборатории
устанавливают из расчета 2,5 Вт/м3.

. Помещения лаборатории должны быть непроницаемы для
грызунов и насекомых.

. П ЦР-лабораторию обеспечивают средствами
пожаротушения.

. Требования к лабораторному оборудованию

. Комплект лабораторного оборудования определяют с
учетом используемых наборов реагентов для выделения НК, амплификации и детекции
результатов исследований. Помещение для каждого этапа проведения ПЦР
обеспечивают своим набором лабораторного оборудования (прилож.

. Приборы, оборудование и средства измерения,
используемые в работе лаборатории, должны быть технически исправны, иметь
технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации. Средства измерения
регулярно подвергают метрологическому контролю. Используемые приборы должны
соответствовать нормам безопасности и электромагнитной совместимости.

. Для проведения исследования используют приборы и расходные
материалы (пробирки, наконечники к микродозаторам), исключающие возможность
перекрестной контаминации исходного материала, выделенных НК и продуктов ПЦР.
Для этого используют:

• термостаты с твердотельным термоблоком;

• пробирки с плотно закрывающимися крышками;

• одноразовые пробирки и наконечники к микродозаторам;

• наконечники, строго соответствующие автоматическим
пипеткам, а пробирки для амплификации — термоциклерам (в соответствии с
инструкцией фирмы-производителя прибора), смена наконечников после завершения
каждой манипуляции является обязательной;

• специальные контейнеры для сброса использованных
наконечников и пробирок, устанавливаемые на рабочих местах.

. Микродозаторы, рабочая поверхность и наружная
поверхность корпуса приборов должны быть устойчивы к действию моющих и
дезинфицирующих средств и ультрафиолетового излучения.

. Для каждого этапа проведения ПЦР-исследований
необходимо предусмотреть наличие холодильников (прилож.

• в комнате приема материала от 4 до 8 °C,
минус 20 °C (для хранения исследуемых проб);

• в комнате выделения НК от 4 до 8 °C и
минус 20 °C для хранения набора выделения НК; от 4 до 8 °C —
для хранения препаратов НК; не допускается хранение препаратов НК в одном
холодильнике с компонентами набора для выделения НК;

• в комнате ПЦР-амплификации от 4 до 8 °C и
минус 20 °C — для хранения наборов обратной транскрипции и
амплификации НК;

• в комнате детекции продуктов амплификации от 4 до 8
°C — для хранения
наборов электрофоретической детекции и ГиФА.

Требования к проведению работ

. Не допускается проведение исследований методом ПЦР в
помещениях, где осуществляют работы по накоплению ПБА и генно-инженерные
работы.

. Работу с ПБА методом ПЦР выполняют специалисты с
высшим и средним специальным образованием, прошедшие подготовку на
лицензированных курсах специализации (повышения квалификации) по
молекулярно-генетическим (ПЦР) методам диагностики.

. Персонал допускают к работе с ПБА только после
проведения инструктажа по соблюдению требований биологической безопасности.

. В ПЦР-лаборатории, выполняющей работы с ПБА,
используют дезинфицирующие средства, разрешенные к применению в установленном
порядке.

. Каждое помещение для проведения исследований методом
ПЦР оснащают индивидуальным набором соответствующего лабораторного
оборудования, расходных материалов и одежды, используемых только в данном
помещении.

. При проведении исследований методом ПЦР
неукоснительно соблюдают следующие правила последовательной обработки
материала.

. Весь поступающий материал направляют в комнату
приема материала.

. Поступивший материал маркируют и регистрируют в
специальном журнале.

. Первичную обработку материала (взятие, маркировка и
центрифугирование проб и др.) проводят только в комнате приема биологического
материала.

. В помещение выделения НК материал доставляют только
в закрытых одноразовых пробирках в виде маркированных аликвот.

. Передачу и доставку аликвот проб обработанного и
обеззараженного материала, а также пробирок с продуктами ПЦР из одного
помещения в другое осуществляют в закрывающихся металлических или пластмассовых
контейнерах.

. После проведения детекции и учета результатов
исследования пробирки с продуктами ПЦР и использованные наконечники к
микродозаторам подвергают первичной обработке дезинфицирующими растворами,
вызывающими деградацию ДНК (например: 0,2 %-ный раствор ДП-2Т или другие,
аналогичные ему, разрешенные к применению для этих целей в установленном
порядке). Процедуру проводят непосредственно в комнате учета результатов
амплификации.

. Окончательную дезактивацию использованных расходных
материалов и реагентов (гель, буфер для электрофореза) производят в автоклавной
комнате.

. Соблюдают поточность продвижения исследуемого
материала и его производных (пробы ДНК или РНК, продукты ПЦР).

. Строго соблюдают условия хранения всех реагентов и
образцов ДНК согласно инструкции к набору реагентов. Образцы ДНК хранят
отдельно от реагентов. Не допускается использование реагентов с истекшим сроком
годности или хранившихся в условиях, не соответствующих требованиям, изложенным
в инструкциях.

. По окончании работы все объекты, содержащие ПБА,
убирают в хранилища (холодильники, шкафы и т.д.), после чего рабочие
поверхности в обязательном порядке подвергаются дезинфекции.

. Остатки ПБА и посуду, использованную на этапах
приема, разбора и первичной обработки материала, подготовки проб и выделения
нуклеиновых кислот, приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР, собирают
в закрывающиеся емкости и передают в автоклавную. Слив необеззараженных
жидкостей в канализационную сеть не допускается.

. Перенос ПБА и использованной посуды для
обеззараживания осуществляют в закрывающихся емкостях, исключающих
инфицирование во время транспортирования.

. Во всех помещениях лаборатории регулярно проводят
влажную уборку. Каждую рабочую зону ПЦР-анализа обеспечивают индивидуальным
промаркированным набором уборочного инвентаря. Не допускается использовать уборочный
инвентарь для уборки других помещений.

. Сотрудников каждой рабочей зоны обеспечивают
спецодеждой: медицинским халатом, шапочкой, перчатками и сменной обувью. При
работе в помещении детекции продуктов амплификации следует надевать бахилы. Перемещение
одежды из зоны в зону категорически не допускается. Рекомендуется использование
одноразовой одежды. Обработку рабочей одежды из зоны детекции продуктов
амплификации проводят отдельно от одежды из других зон. Обеззараживание рабочей
одежды проводят в соответствии с СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с
микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».

. Лабораторию обеспечивают аптечкой стандартной
комплектации для оказания первой медицинской помощи.

Требования
к обработке помещений и обеззараживанию материала

. Обработку помещений проводят в соответствии с
требованиями СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III —
IV групп патогенности и гельминтами». В комнатах, в
которых проводят работу с выделенными НК, рабочие поверхности, штативы,
оборудование следует обеззараживать ежедневно ультрафиолетовым излучением в
течение 1 ч. Полы ежедневно подвергают влажной уборке с применением
дезинфицирующих средств, регламентированных санитарными правилами. Перед
началом работы рабочую поверхность столов дополнительно обрабатывают 70 %-ным
этиловым спиртом. Ежемесячно проводят профилактическую обработку рабочей
поверхности столов и штативов 1 N соляной кислотой.

. Обеззараживание проб проводят в соответствии с МУ
3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного
бактериями I — IV групп патогенности, при работе методом ПЦР».

Действия при возникновении контаминации лаборатории нуклеиновыми кислотами

. При возникновении контаминации лаборатории проводят
следующие мероприятия (прилож.

• утилизацию всех находящихся в «контаминированной»
зоне реактивов;

• утилизацию исследуемых материалов на всех
промежуточных стадиях обработки (кроме исходной);

• генеральную уборку, химическую и ультрафиолетовую
дезинфекцию всех поверхностей лабораторных помещений;

• дезинфекцию мебели, рабочих поверхностей, а также
поверхностей корпусов приборов и оборудования химическим методом и
ультрафиолетовым излучением;

• обработку паром под давлением всей спецодежды
«контаминированной» зоны.

. Случаи контаминации регистрируют в специальном
журнале с указанием мероприятий по ее устранению и результатов
внутрилабораторного контроля.

. Проведение ПЦР-исследований до завершения
деконтаминационных мероприятий не допускается.

Оценка и контроль качества работы ПЦР-лаборатории

. В ПЦР-лаборатории, проводящей работы с ПБА III —
IV групп патогенности, проводят внутрилабораторный контроль
качества дезинфекции, исследование смывов с рабочих поверхностей и воздушной
среды боксов.

. В ПЦР-лаборатории проводят внутрилабораторный
контроль качества ПЦР-исследований. П ЦР-лаборатория принимает участие во
внешнелабораторном контроле качества деятельности генодиагностических
лабораторий.

. Внутрилабораторный контроль проводят с
периодичностью, зависящей от объема выполняемой работы и определяемой
руководителем лаборатории, но не реже одного раза в квартал.

. Контроль осуществляют путем исследования шифрованных
аттестованных контрольных панелей, содержащих «положительные» и «отрицательные»
пробы.

. Количество проб зависит от объема проводимых
исследований и должно быть достаточным для оценки работы сотрудников и
выявления контаминированных участков лаборатории.

. Для выявления возможной контаминации лаборатории
нуклеиновыми кислотами контроль проводят путем взятия смывов с поверхностей.
Смывы с поверхностей берут стерильными ватными тампонами (зондами). Перед
взятием смывов тампоны (зонды) смачивают стерильным физиологическим раствором
или ТЕ-буфером (10 mM Tris, 1 mМ ЭДТА), после чего вращательными движениями протирают
рабочие поверхности. После взятия смыва зонды помещают в микропробирки типа
«эппендорф» с 300 — 400 мкл ТЕ-буфера, вращают в течение 10 — 15 с, избегая
разбрызгивания раствора, и, отжав избыток жидкости о стенки пробирки, удаляют.

Полученные суспензии центрифугируют при 8000g
(12000 об/мин) в течение 1 мин. Надосадочную жидкость отбирают наконечником с
аэрозольным барьером в микропробирку объемом 1,5 мл. Для выделения НК
используют 0,1 — 0,2 мл надосадочной фракции.

. В качестве критериев оценки качества исследований
методом полимеразной цепной реакции в лаборатории учитывают результаты
внутреннего и внешнего лабораторного контроля, а также отсутствие случаев
лабораторной контаминации нуклеиновыми кислотами.

Термины, определения и сокращения

Патогенные биологические агенты (ПБА) — патогенные для человека микроорганизмы (бактерии,
вирусы, хламидии, риккетсии, простейшие, грибы, микоплазмы),
генно-инженерно-модифицированные микроорганизмы, яды биологического
происхождения (токсины), гельминты, а также любые объекты и материалы (включая
полевой, клинический, секционный), подозрительные на содержание перечисленных
агентов.

— система организационных, медико-биологических и
инженерно-технических мероприятий и средств, направленных на защиту работающего
персонала, населения и среды обитания человека от воздействия патогенных
биологических агентов.

— нуклеиновые
кислоты (ДНК и РНК).

— нуклеотидные последовательности с известной первичной структурой,
которые позволяют проводить идентификацию анализируемой НК.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод обнаружения специфического участка НК
в исследуемом биологическом материале путем амплификации in vitro.

— процесс многократного копирования специфического участка ДНК (кДНК), ограниченного
(фланкированного) праймерами.


продукты ПЦР, синтезируемые в процессе амплификации копии ДНК-мишени.

Лабораторная контаминация НК — механический занос положительно реагирующих НК,
прежде всего ампликонов, в исследуемые образцы, приводящий к
ложно-положительным результатам.

Перечень оборудования ПЦР-лаборатории

Для обработки материала и выделения НК

. Центрифуга для пробирок объемом 5 — 100 мл.

. Микроцентрифуга от 12 до 16000g для микроцентрифужных пробирок
объемом 1,5 мл.

. Твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл
с диапазоном рабочих температур 25 — 100 °C.

. Отдельный набор автоматических пипеток переменного
объема.

. Одноразовые полипропиленовые микроцентрифужные
пробирки с завинчивающимися или плотно закрывающимися крышками объемом
1,5 мл.

. Одноразовые наконечники для пипеток переменного
объема с аэрозольным барьером до 200 и до 1000 мкл.

. Одноразовые наконечники для пипеток переменного
объема до 200 мкл.

. Штативы для наконечников, микропробирок объемом 1,5
мл.

. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру
от 2 до 8 °C, минус 20 °

. Емкость с дезинфицирующим раствором.

Для приготовления ПЦР-смеси и проведения амплификации

. Настольный бокс с бактерицидной лампой.

. Одноразовые полипропиленовые пробирки для
амплификации объёмом 0,5 (0,2) мл.

. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема
с аэрозольным барьером до 100 мкл.

. Штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 (0,2)
мл.

. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру
от 2 до 8 °C, минус 20 °C.

. Емкость для сброса отработанных расходных
материалов.

Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР

. Камера для горизонтального электрофореза.

. Источник постоянного тока с напряжением 150 — 460 В.

. Трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей.

. Видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации
результатов.

. Компьютер для анализа результатов электрофореза.

. Микроволновая печь для плавления агарозы.

. Колба коническая из термостойкого стекла для
плавления агарозы объемом 250 мл.

. Мерный цилиндр объемом 1 л.

. Штатив для микропробирок на 0,5 мл.

. Отдельная автоматическая пипетка 10 — 40 мкл.

. Одноразовые наконечники для пипеток переменного
объема до 200 мкл в штативе.

. Холодильник с камерой, поддерживающей температуру от
2 до 8 °C.

Для гибридизационно-ферментной детекции продуктов ПЦР

. Термостат планшетный, поддерживающий температуру 37
°C.

. Вошер (не обязательно).

. Планшетный спектрофотометр.

. Компьютер (должен быть связан через компьютерную
сеть с компьютером, располагающимся в чистой зоне и предназначенным для анализа
результатов гибридизации).

. Восьмиканальная пипетка до 200 мкл.

. Отдельный набор одноканальных автоматических пипеток
переменного объема.

. Одноразовые наконечники для пипеток переменного
объема.

Действия при контаминации лаборатории нуклеиновыми
кислотами

. Сотрудников, проводящих мероприятия по
деконтаминации, обеспечивают одноразовыми халатами, шапочками, бахилами и
перчатками, одноразовой ветошью, емкостями для приготовления необходимых
количеств моющих и дезинфицирующих растворов.

. Каждую зону лаборатории обрабатывают работающие в
ней сотрудники.

. Для обработки каждой зоны используют новый набор
уборочного инвентаря.

. Каждую зону лаборатории разбивают на участки уборки,
например:

• участок 1 — бокс биологической безопасности и
оборудование внутри него;

• участок 2 — внешние поверхности бокса биологической
безопасности;

• участок 3 — шкафы для расходного материала;

• участок 4 — холодильники для хранения реактивов,
образцов проб;

• участок 5 — оборудование, которое используют в
работе, но стоит вне бокса биологической безопасности;

• участок 6 — поверхности помещения (стены, окна,
батареи, потолок, двери и т.д.);

• участок 7 — пол.

. Обработку проводят от участка к участку
последовательно. Каждый участок обрабатывают отдельной ветошью. Перед
обработкой персонал надевает одноразовую одежду, бахилы, шапочки, перчатки;
готовит моющие и дезинфицирующие растворы.

. Поверхности каждого участка вначале обрабатывают
моющим раствором для удаления жировых загрязнений, после чего остатки моющего
средства удаляют ветошью, смоченной водой.

. Затем на поверхность наносят на 30 мин
дезинфицирующий раствор (например, 0,2 %-ный раствор ДП-2Т или аналогичные ему,
разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке). Остатки
дезинфицирующего средства тщательно удаляют ветошью, смоченной водой.

. После завершения указанной обработки проводят
обеззараживание ультрафиолетовым излучением влажных поверхностей в течение 1 ч.

. Мероприятия, описанные в п.п. , повторяют
еще раз.

. Каждый последующий этап обработки проводят в новой
одноразовой одежде (халат, шапочка, бахилы, перчатки) с использованием новой
ветоши. Для удаления остатков нанесенных на поверхность дезинфицирующих средств
ветошь тщательно прополаскивают в чистой воде, обрабатываемую поверхность
протирают несколько раз. После каждого этапа обработки ветошь утилизируют.

. По завершении деконтаминации берут повторные смывы,
которые исследуют на наличие НК возбудителей инфекционных заболеваний,
диагностику которых наиболее часто осуществляют в данной лаборатории, а также
на выявление НК возбудителей, имеющих короткие — менее 300 п.н. — специфические
продукты амплификации (длина специфического фрагмента указана в инструкциях к
тест-системе).

. Для проведения смывов стерильный зонд с ватным
тампоном смачивают в физиологическом растворе или ТЕ-буфере (10 mM Tris,
1 mМ ЭДГА), после чего вращательными движениями протирают
рабочие поверхности оборудования, мебели, дверных ручек и косяков, телефонов и
т.п. Особое внимание уделяют помещениям совместного посещения работников зоны
детекции продуктов амплификации и других сотрудников лаборатории (столовая,
санузел и т.п.). После взятия смывов зонды помещают в микропробирки типа
«эппендорф» с 300 — 400 мкл ТЕ-буфера, вращают в течение 10 — 15 с, избегая
разбрызгивания раствора, и, отжав избыток жидкости о стенки пробирки, удаляют.

. В случае получения в образцах смывов положительных
результатов ПЦР-анализа обработку повторяют.

. Загрязненный расходный материал (пробирки,
наконечники и т.п.) утилизируют.

Государственное санитарно-эпидемиологическое
нормирование
Российской Федерации

Организация работы лабораторий,
использующих методы амплификации
нуклеиновых кислот при работе
с материалом, содержащим
микроорганизмы
I — IV групп патогенности

1. Разработаны Федеральным государственным учреждением науки
«Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора
(В. И. Покровский, Г. А. Шипулин, И. Н. Манзенюк); Федеральным государственным
учреждением здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный
институт «Микроб» Роспотребнадзора (В. В. Кутырев, И. Н. Шарова, Н. А. Осина, В. Е.
Куклев, С. А. Щербакова); Федеральным государственным учреждением
здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный
институт» Роспотребнадзора (А. Н. Куличенко); Федеральным государственным
учреждением науки «Государственный научно-исследовательский институт
стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.
Тарасевича» Роспотребнадзора (Г. М. Игнатьев); Государственным научным центром
вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (И. Г. Дроздов, А. Н.
Сергеев, А. Н. Шиков, А. О. Семенцова, И. Н. Бабкина, В. А. Терновой, А. П.
Агафонов); Федеральным государственным учреждением здравоохранения «Федеральный
центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (А. И. Верещагин, М. В.
Зароченцев, Т. В. Воронцова, Э. Ф. Опочинский).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному
санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 03 декабря
2009 г. № 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 22 декабря 2009 г.

4. Введены в действие с 5 апреля 2010 г.

5. Введены взамен:

— МУ
1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала,
инфицированного микроорганизмами I — II групп патогенности» (Минздрав России,
Москва, 2003);

— МУ
1.3.1888-04 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала,
инфицированного патогенными биологическими агентами III — IV групп
патогенности» (Минздрав России, Москва, 2004);

— МУ 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала,
инфицированного бактериями I — IV групп патогенности, при работе методом ПЦР»
(Минздрав России, Москва, 2001).

1. Область
применения

2.
Нормативные ссылки

3. Общие
положения

4.
Требования к организации работ

5.
Требования к помещениям и оборудованию лаборатории, выполняющей
молекулярно-биологические диагностические исследования

6.
Требования к проведению работ

7.
Требования к защитной одежде

8.
Требования к обработке помещений и обеззараживанию материала

9.
Контроль качества проводимых исследований

Приложение
1. Рекомендуемые схемы размещения помещений
лаборатории, использующей МАНК при работе с материалом, содержащим
микроорганизмы I — IV групп патогенности

Приложение
2. Забор, предварительная обработка, хранение и
перевозка материала на исследование

Приложение
3. Список рекомендуемого оборудования (расходных
материалов) и его примерное размещение в рабочих зонах (помещениях)
лаборатории, использующей МАНК, в соответствии с этапами проведения анализа

Приложение
4. Применение средств индивидуальной защиты в
рабочих зонах лаборатории, использующей МАНК при работе с микроорганизмами I — II групп патогенности

Приложение
5. Порядок обработки и обеззараживания
исследуемого материала, содержащего (подозрительного на содержание)
микроорганизмы I — IV групп патогенности, при проведении работ с
использованием амплификационных технологий

Приложение
6. Порядок обеззараживания и утилизации
отработанного исследуемого материала и отходов после проведения исследований.
Обработка рабочей одежды

Приложение
7. Действия при контаминации лаборатории,
использующей МАНК, нуклеиновыми кислотами и ампликонами

Организация работы лабораторий, использующих
методы амплификации нуклеиновых кислот при работе
с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп
патогенности

1.1. Методические указания предназначены для специалистов
лабораторий, выполняющих работы с использованием методов амплификации
нуклеиновых кислот (МАНК) при исследовании материала, содержащего
(подозрительного на содержание) микроорганизмы I — IV групп патогенности.

1.2. Юридические лица, независимо от организационно-правовых
форм и форм собственности и индивидуальные предприниматели, осуществляющие
деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний,
должны иметь на нее лицензию. Деятельность каждого структурного подразделения
(микробиологической лаборатории, цеха, производственного участка и т.п.),
связанная с использованием ПБА I — IV групп, должна осуществляться на основании
санитарно-эпидемиологического заключения (СП
1.3.1285-03; СП
1.3.2322-08)*.

*
Зарегистрированы Минюстом России 15 мая 2003 г. номер 4545; 21 февраля 2008 г.
номер 11197.

1.3. Методические указания определяют принципы организации лаборатории
и этапы проведения анализа с использованием МАНК: взятие проб, первичная
обработка, хранение, условия перевозки, обеззараживание материала, выделение
нуклеиновых кислот, проведение обратной транскрипции и (или) амплификации,
секвенирование продуктов амплификации, учет и регистрация результатов
исследования биологического материала, пищевых продуктов, материала из объектов
окружающей среды.

1.4. Методические указания регламентируют деятельность персонала
лабораторий при выполнении исследований с помощью МАНК, проводимых с
использованием зарегистрированных в установленном порядке наборов реагентов и
оборудования.

2.1. С П
1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп
патогенности (опасности)». Минздрав России, 2003.

2.2. С П
1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп
патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». Федеральная
служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека,
2008.

2.3. С П 1.2.1318-03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения
о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний
человека I — IV групп патогенности (опасности),
генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического
происхождения и гельминтами». Минздрав России, 2003.

2.4. С П
1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования
микроорганизмов I — IV групп патогенности». Госкомсанэпиднадзор России, 1995.

2.5. СанПиН
2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов
лечебно-профилактических учреждений». Минздрав России, 1999.

2.6. М У № 01-19/123-17 «Методические указания по детекции
патогенной микрофлоры в клиническом материале, пищевых продуктах, объектах
внешней среды и генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной
реакции» от 18.10.96. Госкомсанэпиднадзор России, 1996.

2.7. Р
3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания
воздуха в помещениях». М., 2005.

3.1. Процесс амплификации основан на многократном увеличении
числа копий фрагмента нуклеиновых кислот (ДНК/(кДНК)/РНК) или усилении сигнала
в условиях in vitro, что позволяет обнаружить специфичный участок генома
возбудителя с целью его идентификации.

3.2. Методы амплификации нуклеиновых кислот: полимеразная
цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (ЛЦР), амплификация с удалением
(вытеснением) цепи (SDA), транскрипционно-опосредованная амплификация (ТМА),
реакция амплификации на основе нуклеотид-ной последовательности нуклеиновых
кислот (NASBA), реакция изотермальной транскрипционной амплификации (TAS),
самоподдерживающаяся реакция репликации последовательностей (SSSR или 3SR),
амплификация с использованием QB-репликазы, амплификации по типу катящегося
кольца (RCA) и т.д.

3.3. Методы амплификации сигнала: сигнальная амплификация
или метод «разветвленной» ДНК (bDNA assay), прямой гибридизационный анализ на
основе РНК/ДНК-зондов и т.д.

3.4. Разновидности полимеразной цепной реакции: с «горячим»
стартом (hot-start PCR), мультиплексная (мультипраймерная), гнездовая
(«вложенная», nested PCR), «инвертированная», ассиметричная, метод молекулярных
колоний, длинных фрагментов (Long-range PCR), с быстрой амплификацией концов
кДНК (RACE-PCR), универсальная (broad-range PCR), с обратной транскрипцией
(ОТ-ПЦР, RT-PCR), иммуно-ПЦР (immuno-PCR-IPCR), в режиме «реального времени»
(Real-Time PCR), анализ «по конечной точке» (End-point PCR) и т.д.

3.5. Форматы амплификации нуклеиновых кислот в режиме
«реального времени»:

• с применением интеркалирующих флуоресцентных красителей;

• использование меченых флуоресцентными красителями
олиго-нуклеотидных зондов, комплементарных участку ампликона (гибридизационно-флуоресцентная
детекция), работающих по принципу: гидролиза зондов (линейно разрушаемые зонды
(TaqMan), зондов с инвертированным концевым повтором (молекулярные «маячки»,
molecular beacons), праймер — зондов («скорпионы», Scorpions), гибридизации
зондов (с резонансным переносом энергии (FRET-технология), «амплифлюр»
(Amplifluor) — технологии и т.д.

3.6. Методы исследования, использующие продукты амплификации
нуклеиновых кислот: секвенирование, ДНК-чипы, рестрикционный анализ.

3.7. Методы детекции продуктов амплификации нуклеиновых
кислот:

• электрофоретический (в агарозном или полиакриламидном
геле);

• гибридизационно-флуоресцентный (детекция продукта в режиме
«реального времени» или регистрация продукта после окончания реакции амплификации
(«анализ по конечной точке»),

3.8. Форматы исследования: качественный, количественный.

3.9. Основные характеристики наборов реагентов, используемых
для проведения амплификации нуклеиновых кислот микроорганизмов I — IV групп
патогенности: аналитическая чувствительность, аналитическая специфичность,
диагностическая чувствительность, диагностическая специфичность,
воспроизводимость.

3.10. Методы амплификации нуклеиновых кислот микроорганизмов
I — IV групп патогенности используют:

• как метод экспресс-диагностики при исследовании
биологического материала, взятого от человека, с целью выявления ДНК (РНК)
микроорганизмов I — IV групп патогенности и их количественной оценки;

• как метод специфической индикации патогенных биологических
агентов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах;

• как ускоренный предварительный тест при выполнении
культурального и биологического методов исследования и для идентификации
культур;

• для определения эпидемиологической значимости изолятов на основании
выявления генетических маркеров вирулентности и патогенности,
антибиотикоустойчивости;

• для таксономической характеристики штаммов на основании
выявления специфических видовых, родовых и других маркеров;

• для генотипирования штаммов с целью определения их
происхождения;

• для прогнозирования течения инфекционного заболевания и
оценки эффективности проводимой терапии.

3.11. По результатам анализа выдают ответ о наличии
(качественный или количественный анализ) в пробе специфических фрагментов ДНК или
РНК, имеющих гомологию с определенным участком генома возбудителя инфекционного
заболевания, а также о наличии в исследуемом материале генетических маркеров
или генетически модифицированных ДНК.

4.1. Исследование материала, содержащего (подозрительного на
содержание) микроорганизмы I — IV групп патогенности, методами амплификации
нуклеиновых кислот (сигнала) связано с необходимостью одновременного
обеспечения и соблюдения персоналом правил биологической безопасности и требований
к организации и проведению данных работ с целью предотвращения контаминации
нуклеиновыми кислотами и (или) ампликонами исследуемых проб помещений и
оборудования.

4.2. Данные исследования проводят в организациях, имеющих
лицензию на деятельность, связанную с возбудителями инфекционных заболеваний
человека, в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о
возможности проведения данных работ, выданных в установленном порядке.

4.3. Противоэпидемический режим работы лаборатории должен быть
обеспечен в соответствии с СП
1.3.1285-03 и (или) СП
1.3.2322-08, регламентирующими работу с микроорганизмами I — II и III — IV
групп патогенности соответственно.

4.4. Допускается проведение исследований биологического
материала (без предварительного накопления возбудителя) на наличие ДНК (РНК)
возбудителей бруцеллеза, парентеральных вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции в
лаборатории, имеющей санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности
проведения работ с возбудителями III — IV групп патогенности (с указанием
конкретных видов микроорганизмов), выданное в установленном порядке.

4.4.1. В лаборатории, имеющей санитарно-эпидемиологическое
заключение о возможности проведения работ с возбудителями III — IV групп
патогенности, допускается исследование биологического материала,
подозрительного на инфицирование микроорганизмами II группы патогенности только
в тех случаях, для которых разработаны и утверждены нормативные документы,
регламентирующие порядок проведения таких исследований в условиях данной
лаборатории.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: