Методика, преимущества и недостатки анализа
Полимеразная цепная реакция – что это такое, какие заболевания выявляет, в чем преимущества и недостатки анализа и что значат его результаты – в материале РИА Новости.
Анализ ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. В его основе лежит многократное увеличение малых концентраций фрагментов РНК и ДНК. Полимеразная цепная реакция была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом. Он хотел добиться того, чтобы можно было создать множество копий ДНК за счет фермента ДНК-полимеразы, который участвует в ее репликации. За это Муллис получил Нобелевскую премию по химии. Известно, что еще в начале 1970-х годов похожий метод был представлен другим ученым, однако задумку так и не смогли реализовать. Позже анализ был значительно усовершенствован и широко используется в биологической, биохимической и медицинской практике.
Как работает ПЦР
Для проведения анализа необходимо сложное, современное оборудование.
«Применяется специальный прибор, он называется амплификатор, в который помещается частица вируса или еще что-нибудь, содержащее РНК или ДНК, – рассказал РИА Новости кандидат медицинских наук, клинический фармаколог Андрей Кондрахин. – Дело в том, что РНК и ДНК достаточно маленькие, чтобы их определить, и понять есть ли в теле человека вредоносные микроорганизмы, поэтому делают ПЦР-тест. В большую машину кладут частичку вируса, но она его не распознает, затем добавляются специальные компоненты, праймеры, которые позволяют сделать большое количество этих цепочек РНК. Их становится так много, что машина начинает их «видеть». Даже если есть хоть самая маленькая РНК вируса, например, коронавируса, это позволяет создать множество копий инфекции, что помогает определить, присутствует она в организме или нет. Метод дает результат практически стопроцентной точности. Для определения COVID-19 есть отдельный праймер. Там находится большое число нуклеотидов, из которых строится будущая РНК. Она сначала разрушается, а потом заново выстраивается. Реакция называется цепной, потому что очень быстро это происходит. Как только копий становится много, сразу начинается считывание».
Применение ПЦР
ПЦР-тест обнаруживает наличие возбудителей вирусных заболеваний, когда другими методами этого сделать нельзя. Например, иммунологическими, бактериологическими и микроскопическими исследованиями. Также значительную роль играет фактор времени, потому что анализ делается довольно быстро по сравнению с другими.
«Метод применяется не только для вирусов, но и частичек ДНК, а также бактерий, – пояснил специалист. – Например, мы можем определить, к какому виду бактерия относится, например, к грамотрицательным или грамположительным».
Полимеразную цепную реакцию применяют в криминалистике, когда нужно сделать анализ ДНК с места преступления, его потом сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Также используется для установления отцовства или материнства, нахождения в организме человека вирусов и бактерий, выявления аллергии на некоторые лекарства или их токсичности.
Проведение ПЦР
Для анализа требуется ДНК- или РНК-матрицы, участки которых нужно скопировать, два праймера с необходимыми ферментами, термостабильная ДНК-полимераза, а также некоторые другие компоненты. Метод ПЦР выявляет любую ДНК или РНК живого или мертвого возбудителя. Для их определения используют особые праймеры, в которых содержатся вырожденные позиции РНК или ДНК.
Подготовка материала
Этот этап чрезвычайно важен для проведения анализа ПЦР, потому что большинство ошибок, до 70% случаев, совершается именно во время пробоподготовки, что влияет на конечный результат анализа. Чтобы этого избежать, нужно правильно забрать материал для тестирования и подготовить его. Поэтому во многих лабораториях при заборе крови используются вакуумные системы, которые меньше травмируют человека и не допускают того, чтобы материал для анализа контактировал с окружающей средой или персоналом.
Какие биологические материалы исследуются
В исследовании обычно используются различные биоматериалы:
– Моча. Такой анализ позволяет выявить инфекции мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин.
– Мокрота. Применяется для обнаружения туберкулеза и некоторых других заболеваний легких.
– Биологические жидкости – околоплодная, спинномозговая, суставная и т.
– Соскобы со слизистых оболочек, например, носа или ротоглотки. В основном применяется для обнаружения заболеваний, которые передаются половым путем, а также коронавируса.
– Кровь, сыворотка, плазма. Используются для определения вирусов ЦМВ (цитомегаловируса), ВИЧ, гепатитов B, C, D, G, герпеса, а также исследований человеческих генов.
– Биоптаты. Их забирают методом биопсии.
Преимущества и недостатки метода
ПЦР отличается от других исследований тем, что может обнаружить несколько разных возбудителей одновременно. Для него нужно сдать только один анализ, никаких дополнительных тестов не требуется.
«Преимуществом метода является то, что можно определить возбудителя в малом количестве, просто в мизерном, – объяснил клинический фармаколог. – Благодаря этому можно быстрее поставить диагноз, потому что мы знаем, какой именно микроорганизм начинает развиваться. В тесте пишется концентрация выявленных у ДНК и РНК микроорганизмов, если берется мазок из носа или ротовой полости, а также к какому классу они принадлежат. То есть присутствует четкое понимание, к какому типу относится возбудитель и каково его количество. Мало, много, либо его вообще нет в организме».
По словам Андрея Кондрахина, к одному из минусов теста относятся сложности при заборе материала:
«Самый первый недостаток метода – необходима абсолютная чистота в помещении, ближе к стерильности, потому что попадание даже мельчайших инородных объектов может дать неправильный результат из-за того, что чувствительность аппарата очень высокая. Сразу начнется увеличение концентрации этих частиц, которое машина может прочитать. Второе – чтобы пошла реакция, нужны специальные материалы, праймеры. Для каждой реакции есть свои праймеры – кусочки, из которых будут создаваться новые РНК. Тест небыстрый – по времени может занимать около суток. Кроме этого, нужен обученный, высокопрофессиональный персонал. Сами аппараты довольно громоздкие, хотя сейчас уже есть и установки меньшего размера. Но чем больше машина, тем больше она может прочитать. Это система не для мобильного использования».
Загрязнение материала для теста может произойти также, если при его транспортировке были допущены ошибки, из-за непригодности реагентов, попадании в них крови, клеток эпителия, большого количества слизи.
Разновидности ПЦР
ПЦР-тест бывает нескольких видов:
– ПЦР с обратной транскрипцией. Его применяют для амплификации РНК.
– Инвертированная ПЦР используется, если для анализа есть маленький участок последовательности ДНК или РНК.
– Вложенная ПЦР нужна для уменьшения побочных реакций, для этого в амплификатор помещают два праймера.
– Количественная ПЦР применяется для наблюдения за изменением цепной реакции.
– Ступенчатая ПЦР позволяет снизить связывание праймеров.
Кроме этого, есть асимметричная ПЦР и групп-специфическая ПЦР.
«Существует методика проведения ПЦР в реальном времени, – рассказал Андрей Кондрахин. – Это самый быстрый анализ, как говорится, здесь и сейчас. Его делают при помощи прибора, в котором есть картридж, определяющий только одну инфекцию, например, коронавирус. Кроме него аппарат ничего не видит, как и при обычном ПЦР, однако в таком случае результат можно получить намного быстрее».
Какие инфекции позволяет выявить
Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить у человека инфекционные заболевания, например:
– уреаплазмоз половых органов;
– кандидоз (молочница);
– папилломавирусная инфекция;
– наличие раковых клеток;
– бактериальный вагиноз;
– инфекционный мононуклеоз;
– СПИД (ВИЧ).
Также тестирование помогает выявить наследственную предрасположенность человека к некоторым заболеваниям и оценить гормональный фон.
ПЦР-тест на COVID-19
Для ПЦР-теста на коронавирус у человека берется мазок из носа и ротоглотки. Во время пандемии его рекомендуют сдать всем, кто болеет ОРВИ, гриппом, пневмонией и т. Берут материал для анализа амбулаторно, также специалист может выехать на дом. Согласно требованиям, пациента выписывают после двух отрицательных тестов на наличие инфекции. ПЦР-тесты могут давать ложноположительный или ложноотрицательный результат, в таком случае необходимо повторное исследование.
Как подготовиться к сдаче анализа
«Специальной подготовки вообще не требуется, разве что не принимать пищу за три часа (минимум) перед забором материала, если будут брать мазок из ротовой полости. Частички еды могут извратить результат. Достаточно прополоскать рот с водой и идти на анализ», – пояснил специалист.
Перед мазком также не рекомендуется пить кофе, чай, иные напитки, чистить зубы, полоскать рот освежающими смесями, жевать жевательную резинку, курить. Нос нельзя промывать, закапывать туда капли или мазать лекарствами. Если берут кровь, то ее необходимо сдавать натощак, чтобы результат был максимально точным. Мочу следует собирать в утреннее время суток натощак или через 2-3 часа после приема пищи. Желательно сделать это сразу после сна.
Расшифровка анализа ПЦР
После проведения теста результаты оцениваются и аппаратурой, и специалистами-медиками.
«В конце теста машина сообщает, что она нашла в мазке, а врач-лаборант описывает результат, – объяснил эксперт. – Если в программу машины заложена информация о том, при каких количествах считается тест положительным, значит, это будет делать автомат. В анализе будет либо да, либо нет. Самому человеку ничего расшифровывать не нужно, единственное, что специалист может посмотреть за машиной – это количество кусочков РНК, потому что бывают ложноположительные или ложноотрицательные результаты, если в аппарате произошел сбой. Все равно контроль со стороны врача присутствует».
Насколько точна ПЦР-диагностика инфекций
«ПЦР абсолютно точна, практически 99,9%, потому что аппарат построит абсолютно такую же РНК, как слепок с ключа, один в один. Там ничего нового сделать нельзя. Набор частичек увеличивается до того количества, которое может распознать машина. Сделать это можно, даже если частиц очень мало», – отметил Андрей Кондрахин.
При этом из-за того, что зачастую встречаются ошибки при взятии биологического материала и существует вероятность попадания инородных частичек, могут возникать ложноположительные или ложноотрицательные результаты тестирования на коронавирус.
ПЦР — это метод ДНК-диагностики, который позволяетвыделить в клиническом материале ничтожно малые количества определенного генетического материала, размножить и идентифицировать его.
Что такое ПЦР. Чувствительность и специфичность ПЦР.
Полимеразная цепная реакция, более известная как «ПЦР», не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Мюллисом в 1983 году, за что он был удостоен Нобелевской премии. Причина достаточно проста: ПЦР делает невозможное возможным. Часто её описывают как метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена. «Иглой» является крошечный фрагмент генетического материала – ДНК или РНК, а ПЦР не только точно его обнаруживает, но и позволяет, используя естественное свойство ДНК — репликацию (удвоение), получить множество его копий. Результат? В течение нескольких часов, в результате многократно повторяющихся температурных циклов полимеразной цепной реакции, из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Таким образом, полимеразная цепная реакция является универсальным методом выявления специфических фрагментов ДНК или РНК в пробе с малым их содержанием.
Рис. Схема ПЦР
Изящность, простота исполнения в лабораторных условиях, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности полимеразной цепной реакции принесли новому методу небывалую популярность. За короткое время ПЦР-анализ распространился по всему миру, быстро выйдя из лабораторий научных институтов в сферу практического использования. Метод нашёл применение в археологии, в практике судебной медицины, в области медицинской генетики, прежде всего, для оценки предрасположенности человека к некоторым онкологическим и генетическим заболеваниям. Но особенно широко ПЦР-анализ стал использоваться для диагностики различных инфекционных заболеваний, в частности, заболеваний, передающихся половым путём (ЗППП), диагностики вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекции, туберкулёза, клещевого энцефалита, острых респираторных и кишечных инфекций и множества других. На сегодняшний день практически нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью метода ПЦР. Для диагностики некоторых урогенитальных инфекций, например, Mycoplasmagenitalium – возбудителя воспалительных заболеваний мочеполового тракта, ПЦР как метод молекулярной диагностики, стал «золотым стандартом», проверенным временем и тщательно апробированным клиниче
Достоинства ПЦР как метода молекулярной диагностики. Метод ПЦР, в отличие от других, традиционно используемых для диагностики инфекционных заболеваний (иммуноферментный анализ (ИФА), бактериологический посев, микроскопия и др. ), характеризуется целым рядом достоинств, которые позволили вывести лабораторную диагностику на качественно новый уровень.
Прямое определение наличия возбудителей Выявление методом ПЦР специфического участка ДНК возбудителя в клиническом материале дает прямое указание на присутствие конкретного возбудителя инфекции. В отличие, например, от иммуноферментного анализа, который, выявляя белки-маркеры – «продукты жизнедеятельности» инфекционного агента, дает опосредованное свидетельство наличия инфекции.
Возможность одновременного выявления нескольких микроорганизмов в одной биологической пробе, в отличие от бактериологических методов, где для разных возбудителей используются разные способы культивирования.
Высокая cпецифичность
Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного микро-(макро)-организма участок его генетического материала. Согласно имеющимся данным, специфичность ПЦР-анализа для хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 95-99 %.
Высокая аналитическая чувствительность Любой лабораторный метод характеризуется таким показателем, как аналитическая чувствительность (АЧ). АЧ отражает то минимальное количество «возбудителя», которое обнаруживается данным методом в конкретном клиническом материале. Среди методов диагностики инфекционных возбудителей, ПЦР обладает наиболее высокими (до 99,7 %) показателями чувствительности за счет экспоненциального накопления продукта реакции – искомого фрагмента ДНК. Так, например, аналитическая чувствительность тест-систем, используемых для выявления большинства бактериальных инфекций, составляет 102 — 103 клеток (копий ДНК) в 1 мл биологической пробы. Для сравнения, чувствительность иммунологических и микроскопических тестов — 103 — 107 клеток.
Универсальность процедуры выявления различных возбудителей
Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК или РНК возбудителя. Сходство химического состава нуклеиновых кислот всех микро-(макро)-организмов позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований, а также использовать для диагностики различный биологический материал: соскобы эпителиальных клеток урогенитального тракта, цельную кровь, плазму, сыворотку, мочу, сперму, секрет простаты, фекалии, плевральную и спинномозговую жидкости, мокроту, слюну, биоптаты различных органов и др. Материалом для исследования методом ПЦР могут служить вода, почва, продукты питания.
Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени как, например, при бактериологическом посеве, также нет необходимости сохранять возбудителя в живом состоянии. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при диагностике скрытых или хронических инфекций.
Скорость проведения анализа
Унифицированный метод обработки биоматериала, автоматизация процесса «размножения» искомого фрагмента ДНК и его последующей детекции как продукта реакции, дают возможность провести полный анализ в течение короткого времени (от нескольких часов до одного дня).
Возможность одновременной диагностики многих возбудителей (анаэробов и аэробов; вирусов, бактерий и грибов).
Для некоторых микроорганизмов ПЦР является практически единственным методом диагностики (например, для Mycoplasma genitalium).
Как это используется?
- Диагностика инфекций
- Генетические анализы, в том числе диагностика наследственных заболеваний
- Исследования в судебной медицине и в других областях
Другие статьи раздела
- Распространенный возбудитель инфекций дыхательных путей (фарингиты, синуситы, отиты, бронхиты и пневмонии). Анализы на антитела используются для диагностики инфекции Chlamydophila pneumoniae при длительных инфекциях дыхательных путей.
- Mycoplasma pneumoniae — возбудитель пневмонии человека, острых респираторных заболеваний (ОРЗ), заболеваний верхних дыхательных путей (фарингита, бронхита), а также некоторых нереспираторных заболеваний.
- Азооспермия (azoospermia) — отсутствие сперматозоидов в эякуляте
- Бактерии – одноклеточные микроорганизмы, некоторые из которых могут вызывать заболевания.
- Mycoplasma pneumoniae (микоплазма пневмонии), Chlamydohpila pneumoniae (хламидофила пневмонии, прежнее название Chlamydia pneumoniae)
- Гемоглобин (от др.-греч. Гемо — кровь и лат. globus — шар) – это сложная белковая молекула внутри красных клеток крови – эритроцитов (у человека и позвоночных животных). Гемоглобин составляет примерно 98% массы всех белков эритроцита.
- Гипофиз – непарная железа внутренней секреции, расположенная на основании головного мозга в костном кармане – гипофизарной ямке турецкого седла. Гипофиз вырабатывает гормоны, оказывающие влияние на работу всего организма – рост и развитие, обмен веществ, половую функцию.
- Повышенный рост волос (гирсутизм) может быть следствием не только повышенного уровня андрогенов (см. «гиперандрогения»), но и высокой активности 5-альфа-редуказы в коже (фермента волосяных фолликулов, превращающего тестостерон в гораздо более активный дигидротестостерон.
- По данным ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) заболеваемость в России составляет более 50 человек на 100 000 населения. Имеет важное значение то, что у женщин значительно чаще чем у мужчин (50-90% против 10%) возможно бессимптомное течение заболевания.
- Делеция (ген.) – вид хромосомных мутаций, при котором происходит потеря какого-либо участка хромосомы.
ПЦР-диагностика инфекций в сперме (эякуляте)
ПЦР-анализ на сегодняшний день является одним из высокотехнологичных, доступных и эффективных методов молекулярной диагностики, применяемый в разных областях медицины. Чаще всего он используется для лабораторной диагностики инфекционных заболеваний человека, в том числе инфекций, передаваемых половым путём (ИППП), и выявления возбудителей урогенитальных инфекций, которые могут вызывать различные воспалительные заболевания органов мочеполовой системы у мужчин и женщин.
В этой статье речь пойдет о методе ПЦР для диагностики инфекций, передаваемых половым путем, при анализе спермы (эякулята). Какие инфекции можно определить в сперме, а какие нельзя? Какие еще материалы можно использовать для диагностики инфекций половой системы?
Среди преимуществ ПЦР как метода в сравнении с другими, традиционно используемыми для диагностики инфекционных заболеваний человека (иммуноферментный анализ, бактериологический посев, микроскопия), стоит отметить непосредственное обнаружение инфекционного агента в результате выявления специфического фрагмента ДНК или РНК возбудителя в исследуемом образце, а потому — возможность напрямую идентифицировать возбудителя инфекции, осуществлять раннюю диагностику, например, в инкубационном периоде, диагностировать заболевание не только в острой и хронической формах, но и выявлять скрытые (латентные) формы инфекций, протекающие без выраженных симптомов или бессимптомно, а также проводить скрининговые исследования, направленные как на определение уже имеющейся инфекционной патологии, так и выявление возможного носительства инфекций для оценки принадлежности пациента к группе риска.
Спектр возбудителей, выявляемых методом ПЦР, чрезвычайно широк, в связи с чем наибольшее распространение ПЦР-диагностика получила в гинекологической и урологической практике, в дерматовенерологии. Для диагностики большинства бактериальных и вирусных инфекций, выявления возбудителей ИППП, вызывающих заболевания, передаваемые половым путём (ЗППП), материалом для исследования служит, в основном, соскобное отделяемое слизистых оболочек мочеполовых органов: соскоб эпителиальных клеток из цервикального канала и поверхности шейки матки у женщин, соскоб из уретры (мочеиспускательного канала), выделения из половых органов — у мужчин и женщин. При обследовании на некоторые виды инфекций (ВИЧ, гепатиты В и С, вирус Эпштейна-Барр и др. ) для анализа берут кровь. Для выявления цитомегаловирусной и герпетической инфекций можно исследовать мочу. Клиническим материалом для ПЦР-диагностики ИППП у мужчин может служить секрет предстательной железы и эякулят (сперма). В каждом конкретном случае выбор исследуемого биоматериала определяется диагностической задачей исследования.
В данной статье мы подробнее остановимся на диагностике ИППП у мужчин и возможности выявления возбудителей ЗППП и урогенитальных инфекций в эякуляте.
Инфекционно-воспалительные заболевания органов мужской репродуктивной системы могут явиться одной из возможных причин снижения мужской фертильности (способности к воспроизведению потомства), а урогенитальные инфекции их вызывающие — быть ассоциированы с мужским бесплодием.
К органам мужской репродуктивной системы относятся наружные и внутренние половые органы. К числу наружных относят половой член и мошонку. Внутренние половые органы представлены яичками с их оболочками и придатками, расположенными в мошонке, семявыносящими протоками и добавочными половыми железами, в числе которых предстательная железа (простата) — железисто-мышечный орган, охватывающий мочеиспускательный канал ниже мочевого пузыря, семенные пузырьки — парный железистый орган, расположенный над предстательной железой, и бульбоуретральные (Куперовы) железы — парные округлые железы небольшой величины, расположенные между пучками мышц мочеполовой диафрагмы. В яичках, являющихся парной половой железой, происходит образование мужских половых клеток — сперматозоидов и выработка мужских половых гормонов. Продукты секреции добавочных половых желез образуют семенную жидкость (семенную плазму, или спермоплазму), которая при смешении со сперматозоидами образует сперму. Придаток яичка (эпидидимис) тесно связан с яичком и служит резервуаром накопления спермы и созревания сперматозоидов, являясь частью семявыводящих путей. Семявыносящий проток представляет собой парный трубчатый орган, служащий для транспортировки сперматозоидов из эпидидимиса в семявыбрасывающий проток. При эякуляции (семяизвержении) происходит сокращение продольных мышечных волокон семявыносящего протока, сперматозоиды поступают в семявыносящий проток и смываются содержимым семенных пузырьков в уретру. Вклад секрета семенных пузырьков и предстательной железы в общий объём семенной жидкости составляет около 95% (примерно 35% приходится на секрет предстательной железы, 60% — на секрет семенных пузырьков), поэтому колебания объёма эякулята, в первую очередь, зависят от секрета добавочных половых желез. Тесная функциональная взаимосвязь всех органов мужской половой системы позволяет оценивать её состояние путём исследования эякулята. Среди лабораторных методов исследования анализ эякулята является важнейшим и, зачастую, — достаточным не только для оценки мужской фертильности, например, при анализе спермограммы, но и диагностики наиболее распространённых, репродуктивно значимых урогенитальных инфекций.
Наиболее частыми возбудителями инфекций мужского урогенитального тракта являются бактерии: гонококк (Neisseria gonorrhoea) — возбудитель гонореи, хламидии (Chlamydia trachomatis) — возбудитель урогенитального хламидиоза, трахомы и венерической лимфогранулемы, бледная трепонема (Treponema pallidum) — возбудитель сифилиса, микоплазмы (Mycoplasma genitalium и Mycoplasma hominis) и уреаплазмы (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum), являющиеся инфекционными агентами воспалительных процессов в мочеполовых органах, а также простейшие, например, трихомонада (Trichomonas vaginalis) — возбудитель урогенитального трихомониаза, грибы, например, рода Candida, вызывающие урогенитальный кандидоз, и различные вирусы, среди которых вирусы простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ, Herpes simplex virus, HSV1 и HSV2) — возбудители генитального герпеса, цитомегаловирус (CMV), вирус папилломы человека (ВПЧ, HPV, Human papillomavirus), вирусы гепатита В (HBV), гепатита С (HCV), ВИЧ (HIV) и другие. Некоторые из перечисленных бактериальных возбудителей (гонококк, хламидии, бледная трепонема, генитальная микоплазма) являются патогенами, другие (уреаплазмы, энтерококки, стафилококки и ряд других) — принадлежат к группе условно-патогенных микроорганизмов, способных вызывать воспаление в половых органах при снижении иммунной защиты.
Вирусы и бактерии могут напрямую поражать сперматозоиды, приводя к изменению их подвижности. Так, например, известно, что Mycoplasma genitalium и Ureaplasma urealyticum, прикрепившиеся к головке и средней части сперматозоидов, негативно влияют не только на их подвижность, но и способность к оплодотворению яйцеклетки, проводимому в экспериментальных (in vitro) условиях. Повреждающее действие могут оказывать и продуцируемые микроорганизмами токсины. В ответ на инфекционный процесс развивается вторичное воспалительное повреждение, сопровождаемое образованием свободных радикалов и цитокинов, способных оказывать цитотоксическое воздействие на половые клетки. Кроме того, инфекции являются одним из факторов риска образования антиспермальных антител (АСАТ), направленных против различных частей сперматозоидов. Механизмом образования АСАТ на фоне воспалительного процесса является всё та же способность бактерий, вирусов и грибов прикрепляться к мембране сперматозоидов, вследствие чего происходит запуск аутоиммунных реакций. Присутствие АСАТ в эякуляте приводит к снижению его качественных и количественных характеристик: уменьшению концентрации и подвижности сперматозоидов, изменению морфологии половых клеток, их агглютинации, к изменению значений pH и вязкости семенной плазмы. Тем самым инфекции мочеполовых органов могут снижать репродуктивную функцию у мужчин.
Большинство возбудителей ИППП попадают в организм преимущественно половым путём. Наиболее часто инфекции выявляются у лиц молодого возраста, особенно тех, кто имеет большое число половых партнёров. При незащищенном половом акте высок риск заражения хламидиозом, гонореей, сифилисом, трихомониазом, гепатитами В и С, ВИЧ, герпесом, ВПЧ. Всего в настоящее время насчитывается более двадцати инфекций, которые передаются половым путём. Многие из них характеризуются высокой контагиозностью, а потому — быстрым распространением среди населения. К примеру, ежегодно в мире регистрируется около 90 миллионов новых случаев хламидийной инфекции, а восприимчивость к урогенитальному хламидиозу приближается к 100%. Следует помнить, что заражение ИППП может происходить при любом виде сексуальных контактов: анальном и оральном сексе, генитальном контакте без проникновения. Коварство этих инфекций заключается и в их возможности протекать без клинически выраженных симптомов. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), 50 — 80% населения инфицировано вирусом папилломы человека, но лишь 1 — 2% лиц имеют клинические проявления этой инфекции. Бессимптомное вирусоносительство играет ключевую роль в распространении генитального герпеса: до 70% случаев передачи этого вируса и заражения им здоровых лиц происходит при бессимптомном характере болезни и наличии вируса герпеса у больного. Скрытый характер течения инфекции затрудняет возможность её выявления. Отсутствие со стороны мужчины должного внимания на появление у себя некоторых из признаков или симптомов начинающегося заболевания, несвоевременное обращение к врачу или неадекватное лечение, например, в случае предпринимаемого самолечения, могут способствовать переходу инфекции в хроническу форму и развитию хронического заболевания. Хроническую инфекцию труднее диагностировать, тяжелее лечить, к тому же последствия хронического инфекционно-воспалительного процесса в мочеполовых органах оказываются более тяжкими для мужского здоровья.
В зависимости от локализации инфекционного процесса чаще всего у мужчин развиваются уретрит (воспаление мочеиспускательного канала), цистит (воспаление мочевого пузыря), простатит (воспаление предстательной железы), эпидидимит (воспаление придатка яичка) и орхит (воспаление яичка). Острый эпидидимит может распространиться и на яички (эпидидимоорхит). Симптомы или признаки заболевания напрямую зависят от того, какой именно возбудитель инфекции попал в мужской организм и каково состояние иммунитета в целом. Наиболее частыми возбудителями инфекций, вызывающих уретрит, являются Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoea, Mycoplasma genitalium и Ureaplasma urealyticum. Среди сексуально активных молодых мужчин эпидидимит чаще вызывается Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoea и Trichomonas vaginalis. У мужчин старшего возраста и пожилых чаще обнаруживают условно-патогенную микрофлору (Mycoplasma hominis, Ureaplasma parvum и др.
Симптомы урогенитальных заболеваний, вызываемых различными возбудителями ИППП, чаще всего не являются специфичными. При остром характере инфекционного-воспалительного процесса клиническая картина ИППП у мужчин может выражаться такими симптомами, как дискомфорт, зуд и жжение в области уретры, боль в промежности, нижней части живота и в области мошонки, болезненность при мочеиспускании (дизурия) и половых контактах (диспареуния), гиперемия и отёчность кожных покровов в области поражения, слизистые или гнойные выделения из уретры. В случае скрытой формы инфекции признаками заражения могут являться редкие, незначительные выделения из уретры. Сходство клинических проявлений многих урогенитальных инфекций вовсе не означает, что существует их одинаковое лечение, каждая инфекция требует индивидуальной медикаментозной терапии. Это диктует необходимость проведения лабораторного исследования, направленного на выявление и идентификацию возбудителей ИППП.
Одним из таких видов исследования, предлагаемых в нашей клинике для мужчин, является анализ эякулята с помощью молекулярно-биологического метода ПЦР. Исследование является скрининговым и представляет собой блок анализов ПЦР на инфекции в сперме. Предназначен для обнаружения в биоматериале специфических фрагментов ДНК основных возбудителей ИППП и урогенитальных инфекций мочеполового тракта у мужчин: Neisseria gonorrhoeae, Clamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis и Ureaplasma spp. Обследование не требует применения каких-либо инвазивных процедур, а потому может быть выполнено в кратчайшие сроки. Использование для этих целей современного высокочувствительного и высокоточного диагностического метода, каким является ПЦР-анализ, представляется в настоящее время неотъемлемой частью комплексного подхода в лабораторной оценке мужского репродуктивного здоровья.
- MAR-тест (мар-тест) определяет процент сперматозоидов, связанных с антителами классов IgG и IgA (прямой MAR-тест) и титр антиспермальных антител (АСАТ) в биологических жидкостях (спермоплазма, слизь шейки матки, плазма крови) (непрямой MAR-тест). Тест является международно признанным стандартом диагностики АСАТ.
- Если врач уже выдал Вам направление, и Вы готовы сдать спермограмму, то в этой статье мы расскажем про разновидности этого анализа. Что вообще такое анализ спермограммы, для чего он необходим, Вы можете прочитать в этой статье.
- Анализы для ЭКО в лаборатории репродукции ЦИРВ некоторых случаях бесплодия паре требуется проведение ЭКО – экстракорпорального оплодотворения или оплодотворения в пробирке. Перед ЭКО обязательно проводится обследование, в том числе, анализы и УЗИ.Все необходимые анализы Вы можете сдать в нашей лаборатории ЦИР.
- Что такое антиспермальные анитела (АСАТ), какие они бывают, какие методы диагностики АСАТ применяются в Лаборатории ЦИР.
- Спермограмма — в каких случаях, для чего она необходима, и как проводится это исследование
ПЦР расшифровывается как «полимеразная цепная реакция». Это метод лабораторной диагностики, цель которого заключается в выявлении возбудителя инфекционного заболевания. Он является золотым стандартом в диагностике возбудителей, который был многократно проверен. ПЦР дает возможность определить патогенный микроорганизм даже в том случае, если в исследуемом материале присутствует всего несколько его молекул ДНК.
- Как работает ПЦР-анализ?
- Преимущества ПЦР-анализа
- Показания к проведению ПЦР-теста
- Типы ПЦР
- Подготовка к анализу
- Материалы для ПЦР-анализа
- Расшифровка результатов ПЦР-тестирования
Как работает ПЦР-анализ?
Практически все живые существа на планете, исключая некоторые вирусы с РНК-геномами, имеют генетический материал, представленный длинной двухцепочной молекулой ДНК. Цепочка ДНК включает нуклеотиды — небольшие молекулы с универсальным строением. Они могут идти в цепочке ДНК в разном порядке. В зависимости от этого «собираются» разные геномы.
У каждого болезнетворного микроорганизма есть свой, уникальный порядок построения цепочки ДНК, поэтому его невозможно спутать с ДНК человека.
При проведении теста ПЦР используют фрагмент чужеродного генетического материала, добытый из образца, и размножают много раз с помощью белка-фермента. За несколько часов количество копий увеличивается в несколько миллиардов раз. Это позволяет получить такое количество ДНК, которого достаточно для успешного определения его природы.
В лабораториях используют определенный набор реактивов для каждого конкретного микроорганизма, поэтому пациентам назначают не общий ПЦР-анализ, а тест на конкретный микроорганизм (например, на вирус гепатита С).
Полимеразная цепная реакция проводится качественно и количественно. Качественный тест позволяет определить, есть ли в образце генетический материал микроорганизма (вируса или бактерии), который ищет врач. Количественный тест дает информацию о том, в каком количестве содержится материал.
Преимущества ПЦР-анализа
К достоинствам этого диагностического метода относят:
- Универсальность. ПЦР-тест обнаруживает любые ДНК и РНК, даже в тех случаях, если другие диагностические методы не дали результата.
- Эффективность. Полимеразная цепная реакция позволяет диагностировать некультивируемые, трудно культивируемые и латентно существующие формы патогенных микроорганизмов.
- Высокую чувствительность. Даже если в исследуемом материале присутствует всего один фрагмент генетического материала возбудителя, тест все равно показывает его.
- Высокую специфичность метода, достигающую 100%. В ходе диагностики выявляют уникальную последовательность нуклеотидов в цепочке ДНК, характерную только для конкретного патогенного микроорганизма, провоцирующего развитие заболевания.
- Высокую скорость выполнения. Для установки реакции достаточно несколько часов. Пациент получает результаты анализа на следующий день после сдачи.
ПЦР-тест направлен на определение возбудителя заболевания, а не на реакцию на его проникновение со стороны организма.
Показания к проведению ПЦР-теста
Анализ проводят при инфекционных заболеваниях для определения природы их возбудителя. Также его назначают при:
- необходимости точно установить конкретный болезнетворный микроорганизм;
- диагностике лейкоза и других злокачественных новообразований;
- диагностике некоторых генетически обусловленных заболеваний;
- исследовании образцов биопсии, которые невозможно изучить с помощью других методов.
С помощью ПЦР-анализа выявляют различные заболевания:
- инфекционные (ВИЧ, гепатит, ТОРЧ-инфекции и т.д.);
- передающиеся половым путем (хламидии, микоплазмы, кандиды);
- внутриутробные инфекции (вирусы краснухи, герпеса, токсоплазмы);
- респираторные (в настоящее время ПЦР-тест является золотым стандартом в диагностике вируса Ковид-19);
- генетические.
С помощью ПЦР можно провести тест на определение отцовства.
Типы ПЦР
Диагностика на основе полимеразной цепной реакции имеет несколько разновидностей. Она может быть:
- инвертированной;
- с обратной транскрипцией;
- количественной;
- вложенной;
- ступенчатой.
Наиболее надежный метод — ПЦР в режиме реального времени. Это количественный или полуколичественный способ диагностики, который предусматривает постоянное наблюдение образца генетического материала датчиком. Последний регистрирует сигналы на каждом цикле реакции.
Подготовка к анализу
При подготовке к ПЦР-анализу нужно соблюдать несколько правил:
- За 10-14 дней до назначенного теста прекратить прием любых препаратов и отказаться от проведения лечебных процедур, включая физиотерапевтические. Если прием лекарственных средств жизненно необходим, об этом нужно предупредить врача заранее.
- В случае забора мазка на выявление заболеваний, передающихся половым путем, нужно в течение суток перед исследованием отказаться от спринцеваний, использования тампонов и лечебных суппозиториев, применения антисептических средств. Также в этот период необходимо воздерживаться от половых актов. За 2 часа до забора мазка нельзя мочиться.
- Если выполняется забор мазка из зева, за 3 часа до анализа нельзя чистить зубы, пить, полоскать рот (даже простой водой).
- За трое суток до сдачи материала на ПЦР-исследование нужно полностью отказаться от употребления алкоголя.
- За двое суток до проведения теста нужно исключить повышенные физические нагрузки.
Материалы для ПЦР-анализа
В зависимости от направленности теста ПЦР, в качестве материала для исследования используют:
- кровь (сыворотка или плазма);
- соскобы эпителиальных клеток (с кожных покровов, слизистой оболочки уретры, цервикального канала);
- различные биологические жидкости (околоплодная, суставная, спинномозговая жидкости, секрет предстательной железы);
- мазок из зева;
- различные биологические выделения (слюна, моча, мокрота);
- биоптат (материал, полученный путем проведения биопсии).
Расшифровка результатов ПЦР-тестирования
Результат ПЦР-анализа либо положительный, либо отрицательный. Положительный указывает на то, что у человека присутствуют фрагменты ДНК возбудителя заболевания, то есть, что человек заражен и ему необходимо лечение. Отрицательный результат ПЦР-анализа свидетельствует об отсутствии следов ДНК патогена. В таком случае человек здоров.
В некоторых случаях ПЦР-тест дает положительный результат, хотя человек не ощущает недомогания и специфических симптомов заражения. Это значит, что заболевание выявлено на ранней стадии развития. Для уточнения диагноза назначают дополнительные исследования, а затем, с учетом их результата, начинают курс лечения.
ПЦР (полимеразная цепная реакция) – на сегодняшний день самый быстрый и достоверный метод диагностики инфекционных заболеваний. Принцип метода полимеразной цепной реакции был разработан Кэри Мюлисом (Kary Mullis) в 1983 г. За свое открытие К. Мюллис в 1993 г получил Нобелевскую премию по химии. Метод ПЦР позволяет добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Метод основан на многократном избирательном копировании (амплификации) определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях. Преимущества метода ПЦР диагностики как метода диагностики инфекционных заболеванийПрямое определение наличия возбудителейМногие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. Высокая специфичностьВысокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. Высокая чувствительностьМетод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР анализ обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР анализа составляет 10-100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов — 103-105 клеток). Универсальность процедуры выявления различных возбудителейМатериалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. Высокая скорость получения результата анализаДля проведения ПЦР анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-5 часов. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекцийОсобенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Материалом для осуществления ПЦР-диагностики могут служить
- Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек. Обычно используются для диагностики заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП), таких как гонорея, хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез, герпетическая и другие инфекции, поражающие слизистые оболочки.
- Моча. Моча может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин (у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб).
- Мокрота. Мокрота используется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный (одноразовый) флакон.
- Кровь, плазма, сыворотка. Используются для ПЦР анализа вирусов гепатитов B, C, D, G, герпеса, ЦМВ, ВИЧ, исследования генов человека.
- Биологические жидкости. Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям.
- Биоптаты. Чаще всего используют биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления хеликобактерной инфекции.
Стоимость ПЦР анализа в нашем медцентрер. — рабочий день, кол. — количественный, кач. — качественный, ген. — генотипирование, АЖ — амниотическая жидкость, БАЛ — бронхо-альвеолярный лаваж, СМЖ — спинно-мозговая жидкость, ПЖ — плевральная жидкость
Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.
Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов.
Сеть независимых лабораторий «Ситилаб» в своей работе для диагностики инфекционных заболеваний использует 3 группы специальных лабораторных методов исследования:
- бактериологические;
- серологические;
- метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом материале.
У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.
