ВИРУСОЛОГИЯ

ВИРУСОЛОГИЯ

Категория слушателей:
зооветспециалисты

Выдаваемый документ:
удостоверение установленного образца

Объем:
18/36/72 ч.

Формы обучения:
очно

Формат обучения:
индивидуальная стажировка

Продолжительность:
3/5/9 дней

Стоимость обучения

Объем 18 часов.

Объем 36 часов.

Объем 72 часа.

* — При организации обучения по предложенным тематикам перечень изучаемых вопросов и их объем согласуется с заказчиком.

Материально-техническое обеспечение

Принцип РТГА
состоит в том, что в пробирке смешивают
равные объемы сыворотки крови и суспензии
вируса и после экспозиции определяют,
сохранился ли в смеси вирус, путем
добавления суспензии эритроцитов.
Агглютинация эритроцитов указывает на
наличие, а отсутствие гемагглютинации
– на отсутствие вируса в смеси.
Исчезновение вируса из смеси вирус +
сыворотка расценивается как признак
взаимодействия антител сыворотки и
вируса.

Но антитела с
антигенами взаимодействуют в строго
определенных количественных соотношениях.
Поэтому, для того чтобы определенное
количество вируса было лишено
гемагглютинирующей способности,
требуется определенный минимум антител,
а так как один из компонентов РТГА всегда
неизвестен, приходится реакцию ставить
в ряду пробирок с различными дозами
антител и одинаковыми дозами вируса
или наоборот. Это достигается тем, что
берут или разные разведения сыворотки
и одно и то же разведение вируса, или
разные разведения вируса и одно и то же
разведение сыворотки.

РТГА позволяет
решать следующие задачи: определять
титр антител к гемагглютинирующему
вирусу в сыворотке; идентифицировать
неизвестный гемагглютинирующий вирус
по известным сывороткам; установить
степень антигенного родства двух
вирусов.

Достоинства
РТГА: простота
техники, быстрота, не требуется стерильной
работы, специфичность, дешевизна.
Недостаток: РТГА возможна только с
гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования
антител в РТГА
состоит в следующем:

– готовят ряд
последовательных (обычно 2-кратных)
разведений исследуемой сыворотки в
одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2
мл);

– к каждому
разведению добавляют такие же объемы
гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ;

– смеси выдерживают
определенное время при определенной
температуре (для вируса ньюкаслской
болезни 40–60 мин при комнатной температуре);

– ко всем смесям
добавляют равные объемы 1%-ной суспензии
отмытых эритроцитов;

– после экспозиции
оценивают гемагглютинацию в каждой
смеси в крестах.

В реакции
предусматриваются контроли сыворотки,
вируса и эритроцитов.

То наивысшее
разведение сыворотки, которое еще
полностью тормозит гемагглютинацию,
принимается за показатель титра антител
в этой сыворотке.

РГАд.
Гемадсорбция
– соединение эритроцитов с поверхностью
пораженных вирусом клеток – впервые
была обнаружена Фогелем и Щелоковым
(1957) на культуре ткани, инфицированной
вирусом гриппа. В основе этого явления
лежит родство рецепторов вируса,
находящихся на поверхности пораженной
клетки, с рецепторами эритроцита, что
приводит к их взаимному сцеплению
аналогично реакции гемагглютинации.
Преимущество этой реакции состоит в
том, что она становится положительной
еще до появления отчетливых цитопатических
изменений в инфицированных клетках.

Методика РГАд
состоит в следующем. На 3–4-й день после
инфицирования клеток берут две пробирки
с одинаковой культурой клеток, из которых
одна заражена вируссодержащим материалом,
а вторая контрольная. Из обеих пробирок
сливают культуральную жидкость и вносят
в обе по 2–3 капли 0,5%-ной суспензии
отмытых эритроцитов. Обе пробирки
оставляют на 5–10 мин так, чтобы эритроциты
были на поверхности клеток (кладут
горизонтально на стол), а затем слегка
споласкивают физраствором и исследуют
под микроскопом (малое увеличение). В
контрольной пробирке эритроциты
полностью удаляются с физраствором, а
некоторые из оставшихся плывут вместе
с жидкостью. Если в зараженной пробирке
эритроциты не удалились с физраствором
и не плывут, а прикреплены к поверхности
клеток, следует считать РГАд положительной.

В зависимости от
вируса и вида клеток расположение
эритроцитов может быть трояким:

– эритроциты
адсорбированы только по периферии
клеточного пласта в виде «ожерелья»
(вирус африканской чумы свиней);

– эритроциты
расположены на слое клеток очагами или
скоплениями (вирус гриппа);

– эритроциты
расположены на слое клеток диффузно
(вирус парагриппа).

Каждый вирус
способен адсорбировать эритроциты
крови животных определенных видов.

Реакция
нейтрализации основана на способности
специфических вируснейтрализующих
антител блокировать инфекционные,
гемагглютинирующие, гемадсорбирующие,
цитопатические, бляшкообразующие и др.
свойства вирусов.

Она
применяется в двух направлениях:

Реакции
нейтрализации ставят в культурах клеток,
куриных эмбрионах и на лабораторных
животных.

Принцип.
Смесью вирус (исследуемый или известный)
+ сыворотка (диагностическая или
исследуемая), выдержанной в течение
определенного времени, заражают культуру
клеток, куриный эмбрион или лабораторное
животное. При (+} реакции, т.е. при
нейтрализации вируса антителами
индикаторные объекты продолжают
нормально существовать, а в контроле —
гибель или характерные изменения.

В
основе РГА лежит способность эритроцитов
склеиваться при адсорбции на них
определенных антигенов. В качестве
исследуемого материала при гемагглютинации
используют аллантоисную, амниотическую
жидкость, суспензию хорионаллантоисных
оболочек куринных эмбрионов, взвеси и
экстракты из культур или органов
животных, зараженных вирусами, нативный
инфекционный материал. Р ГА не является
серологической, поскольку происходит
без участия иммунной сыворотки и
используется для выбора рабочего
разведения антигена для постановки
РТГА или наличия антигена (вируса) в
исследуемом материале (например, при
гриппе). В реакции используются эритроциты
животных, птиц, человека I (0) группы
крови.

Для
постановки ориентировочной РГА на
предметное стекло наносят каплю 5% взвеси
эритроцитов и каплю испытуемого
материала, тщательно смешивают. При
положительном результате через 1-2 минуты
макроскопически наблюдают появление
хлопьевидной агглютинации эритроцитов.

Для
постановки РГА в развернутом ряду в
лунках полистероловых планшетов готовят
двукратно возрастающие разведения
исследуемого материала на физиологическом
растворе в объёме 0,5 мл. Во все пробирки
вносят по 0,5 мл 0,25 — 1% взвеси эритроцитов.
Результаты учитывают после полного
оседания эритроцитов в контроле
(эритроциты + физиологический раствор).
Реакцию учитывают по характеру осадка
эритроцитов. В положительных случаях
степень агглютинации отмечают плюсами.
Четырьмя плюсами оценивают реакцию,
имеющую вид тонкой пленки из склеившихся
эритроцитов, покрывающей дно пробирки
(зонтик), реакцию с просветами в пленке
отмечают тремя плюсами, наличие пленки
с фестончатыми кружевными краями из
склеившихся эритроцитов обозначают
двумя плюсами, хлопьевидный осадок
эритроцитов, окруженный зоной комочков
агглютинированных эритроцитов
соответствует одному плюсу. Резко
очерченный осадок эритроцитов, неотличимый
от контроля показывает отсутствие
агглютинации. За титр принимают предельное
разведение исследуемого материала,
вызвавшее агглютинацию эритроцитов на
два плюса.

При
положительном результате РГА исследование
продолжают, определяя тип выделенного
вируса с помощью реакции торможения
гемагглютинации типоспецифическими
сыворотками.

РТГА
основана на свойстве антисыворотки
подавлять вирусную гемагглютинацию,
так как нейтрализованный специфичными
антителами вирус утрачивает способность
агглютинировать эритроциты. При
ориентировочном типировании вирусов
используют капельный метод на стекле.
Для окончательного установления типовой
принадлежности выделенного вируса и
титрования антител в сыворотках ставят
развернутую РТГА в пробирках или в
лунках. С этой целью готовят двухкратные
разведения сывороток на физиологическом
растворе и разливают по 0,25 мл. К разведениям
сыворотки прибавляют по одной капле
материала, содержащего вирус и по одной
капле 1% взвеси эритроцитов.

При
использовании РТГА для определения
типа вируса, используют типоспецифические
сыворотки, которые добавляют к равному
объему рабочего разведения антигена.
Типовую принадлежность выделенного
вируса устанавливают по специфической
иммунной сыворотке, показавшей наивысший
титр антител к этому вирусу.

РГА
и РТГА широко применяется для диагностики
вирусных инфекций (клещевой энцефалит,
грипп и др.) с целью обнаружения
специфических антител и для идентификации
многих вирусов по их антигенам.

Реакция
гемадсорбции (Ргад)
ставится на культурах ткани при некоторых
вирусных болезнях с целью обнаружения
вируса в клетках зараженных культур
ткани на ранних стадиях размножения
вируса, то есть до появления цитопатогенного
действия (ЦПД). По своей сущности эта
реакция не является серологической и
основана на способности зараженных
вирусом клеток культуры ткани адсорбировать
на себе эритроциты.

Для
постановки РГад используют зараженные
вирусом культуры ткани в пробирках. В
пробирки с культурой ткани, зараженной
вирусом, не удаляя поддерживающую среду,
вносят 0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов. После
этого пробирки оставляют в наклонном
положении под углом в 7-10° на 10-15 минут
и по истечению этого времени просматривают
под микроскопом. При постановке реакции
во втором варианте из пробирок с
зараженной культурой ткани предварительно
сливают культуральную жидкость, затем
вносят 0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов,
пробирки оставляют в наклонном положении
на 10-15 минут, затем культуру ткани
промывают физиологическим раствором
(осторожно споласкивают и сливают) и
смотрят под микроскопом. При положительной
реакции эритроциты адсорбируются на
зараженных клетках и хорошо видны в
форме гроздьев, розеток или беспорядочных
скоплений. Если клетки не инфицированы
вирусом, то на них эритроциты не
адсорбируются и свободно плавают в
культуральной жидкости (в первом
варианте) или смываются при промывании
физраствором и не видны (во втором
варианте).

Реакция
задержки гемадсорбции.
В основе этой серологической реакции
задержки гемадсорбции (РЗГад) лежит
способность специфической иммунной
сыворотки нейтрализовать гемадсорбирующие
свойства клеток культуры ткани, зараженных
вирусом. С помощью РЗГад можно
идентифицировать вирус по известной
иммунной сыворотке или выявлять антитела
в исследуемых сыворотках крови по
известному антигену (вирусу).

Для
постановки реакции из зараженных
пробирок с культурой ткани сливают
поддерживающую среду и культуру ткани
промывают ополаскиванием раствором
Хенкса, затем в пробирки вносят по 0,2 мл
специфической иммунной сыворотки и 0,8
мл раствора Хенкса (в контрольные
пробирки вносят только раствор Хенкса
без добавления сыворотки). Сыворотку с
зараженной культурой ткани вылеживают
в термостате или при комнатной температуре
40-60 минут и затем в пробирки вносят по
0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов, оставляют
на 10-15 минут и просматривают под
микроскопом.

1) пo циToПaTическoMy
эффекту, или ЦиToПaTиЧесKoMy Действиto (ЦПЭ,
ЦПД);

1)пo пoлoжительнoй
pеaкции геМaДсopбции (PГAД);

3) пo oбpaзовaниrо
бляшеK;

4)Пo oбнapyжению
BHyтpиKЛеТoчHЬIx BКЛЮченИЙ;

5) пo выявлению
вирусов в реакции иммунофлуренции (PИФ)

6)пo обнapyжению
интерференции BиpyсoB;

7) Пo ПoДaBЛениЮ
MеTaбoлизмa кЛеToК (цветнaя

8)Электронной
микpoскoпиeЙ и дp

. Ц ПД называются
любые изменения клеток под влиянием
размножающегося в культуре клеток
вируса. Физиологические изменения
клеток установить довольно сложно, а
морфологические изменения обнаруживаются
довольно легко. Для этого достаточно
положить на предметный столик микроскопа
пробирку или матрас слоем клеток вверх
и, используя малое увеличение (объектив
х8—10, окуляр х7—10), осмотреть слой.
Полезно сравнить клетки, зараженные
вирусом, с такими же клетками в пробирке,
не подвергавшимися заражению. В этом
случае практически любые наблюдаемые
в микроскоп отличия зараженной культуры
клеток от контрольной можно считать
проявлением ЦПД. Эти отличия могут
захватывать весь монослой или отмечаться
только в виде небольших очажков измененных
клеток в слое нормальных клеток.
Интенсивность ЦПД выражается тем, какая
часть клеточного монослоя изменена
вирусом. Хотя общепринятой системы
оценки интенсивности ЦПД нет, ее часто
оценивают в крестах или баллах. Так,
если изменению (по сравнению с контролем)
подвергся весь монослой в пробирке или
матрасе, ЦПД оценивают на четыре креста,
если 3/4 — на 3 креста, если 1/2 – на 2 креста,
1/4 — на один крест. Но эти оценки все же
весьма условны.

Формы ЦПД зависят
от биологических свойств вируса, вида
клеток, дозы заражения, условий
культивирования и т. д. Одни вирусы
проявляют ЦПД через 2—3 сут после
заражения (энтеровирусы), другие — через
1—2 нед (аденовирусы).

Наиболее существенно
различаются между собой три формы ЦПД:
фрагментация клеток, округление клеток,
симпластообразование (рис. 1,2)

Фрагментация —
разрушение клеток на отдельные фрагменты,
которые отделяются от стекла и переходят
в культуральную жидкость в виде клеточного
детрита (вирус везикулярного стоматита).

Округление —
потеря клетками способности прикрепляться
к стеклу, вследствие чего клетки, обычно
распластанные по стеклу, принимают
шаровидную форму, отделяются от стекла
и свободно плавают в культуральной
жидкости, где и погибают (энтеровирусы,
аденовирусы и др.).

Симпластообразование
— растворение клеточных оболочек,
вследствие чего цитоплазмы соседних
клеток сливаются, образуя одно целое,
в котором располагаются (главным образом
по периферии) ядра клеток. Такие
образования из цитоплазматической
массы с многими клеточными ядрами
называются симпластами (гигантские
многоядерные клетки).

Отсутствие ЦПД в
первом пассаже еще не говорит об
отсутствии вируса, который не всегда
размножается настолько быстро, чтобы
вызвать ярко выраженное ЦПД. Поэтому и
прибегают к «слепым» пассажам.
Необходимо провести не менее трех
«слепых» пассажей, прежде чем судить
о наличии вируса в исследуемом материале.

2)РГАд. Гемадсорбция
— соединение эритроцитов с поверхностью
пораженных вирусом клеток. Преимущество
этой реакции состоит в том, что она
становится положительной еще до появления
отчетливых цитопатических изменений
в инфицированных клетках. Для постановки
реакции используют эритроциты морской
свинки, обезьян, человека (группы О) и
другие эритроциты, чувствительные к
гемагглютинирующему действию изучаемого
вируса.

Состоит в следующем.
На 3—4-й день после инфицирования клеток
берут две пробирки с одинаковой культурой
клеток, из которых одна заражена
вируссодержащим материалом, а вторая
контрольная. Из обеих пробирок сливают
культуральную жидкость и вносят в обе
по 2—3 капли 0,5%-ной суспензии отмытых
эритроцитов. Обе пробирки оставляют на
5—10 мин так, чтобы эритроциты были на
поверхности клеток (кладут горизонтально
на стол), а затем слегка споласкивают
физраствором и исследуют под микроскопом
(малое увеличение). В контрольной пробирке
эритроциты полностью удаляются с
физраствором, а некоторые из оставшихся
плывут вместе с жидкостью. Если в
зараженной пробирке эритроциты не
удалились с физраствором и не плывут,
а прикреплены к поверхности клеток,
следует считать РГАд положительной

-эритроциты
адсорбированы только по периферии
клеточного пласта в виде «ожерелья»
(вирус африканской чумы свиней);

-эритроциты
расположены на слое клеток очагами или
скоплениями (вирус гриппа);

-эритроциты
расположены на слое клеток диффузно
(вирус парагриппа).

Каждый вирус
способен адсорбировать эритроциты
крови животных определенных видов. Если
вирус на данной культуре клеток вызывает
и ЦПД, и РГАд, то гемадсорбция проявляется
раньше, чем ЦПД. Метод этот пригоден для
индикации в культурах клеток только
некоторых вирусов и поэтому применяется
нечасто. Однако для индикации ряда
вирусов (вирусы африканской чумы свиней,
парагриппа-3 крупного рогатого скота и
др.) он незаменим При отсутствии
гемадсорбции на 3—4-й день после
инфицирования через каждые 2—3 дня берут
следующие пробирки с инфицированной
культурой клеток и ставят РГАд по
описанной выше методике. Пробирки с
культурой клеток находятся под наблюдением
в течение 14—20 дней. При отрицательной
реакции гемадсорбции в первом пассаже
проводят следующий пассаж и РГАд.

РГАд используют
для обнаружения вируса в культуре
клеток, для титрования его и при постановке
реакции нейтрализации с целью определения
титра антител в сыворотках крови
животных.

Этот метод
обнаружения вирусов технически сложнее
других и применяется главным образом
для титрования вирусов.

Метод бляшек
основан на образовании вирусом в
однослойных культурах, залитых агаровой
средой, содержащей витальный краситель
— нейтральрот, негативных колоний или
бляшек. Бляшки представляют собой
обесцвеченные участки культуры, состоящие
из погибших под действием вируса клеток.
Кроме агара в целях предотвращения
переноса вируса на другие места можно
использовать крахмал и метилцеллюлозу.
Некоторые вирусы дают бляшки без покрытия
слоем агара, например вирус чумы крупного
рогатого скота, осповакцины, некоторые
представители вирусов герпеса и др.

При постановке
бляшек особое внимание должно быть
обращено на качество культуры, она
должна иметь сплошной рост клеток без
признаков дегенерации. Лучше всего
использовать культуры, выращенные во
флаконах или матрасах различного типа.
На клетки, промытые средой или раствором
Хенкса, наносят вирус в определенных
разведениях и обеспечивают контакт
вируса с клетками при периодическом
покачивании в точно установленный
отрезок времени (1-2ч) при 37 -38 градусах
Цельсия. Неадсорбировавшийся вирус
удаляют путем промывания раствором
Хэнкса или отсасывают пастеровской
пипеткой, затем на слой клеток наносят
специальное агаровое покрытие. Выбор
среды покрытия определяется видом
клеток и вируса.

Обычные компоненты
агарового покрытия — агар, раствор
Эрла, телячья сыворотка, нейтральный
красный, раствор соды (NaHC03), среда,
антибиотики.

После застывания
(30—60 мин) с поверхности агара сливают
конденсированную влагу, флаконы переносят
в термостат и инкубируют клетками вверх.
Время инкубации и температура должны
быть оптимальными для бляшкообразования,
вызываемого данным вирусом. Наблюдение
за появлением бляшек проводят в течение
нескольких дней. За это время вирусы,
адсорбировавшиеся на клетках, проникают
в последние, проходят цикл репродукции,
выходят из клеток и поражают соседние
клетки. В сплошном слое живых клеток
возникают островки мертвых, погибших
вследствие репродукции в них вируса
клеток. Раствор красителя окрашивает
только живые клетки. Поэтому в матрасе
на ровном красновато-розовом фоне
появляются бесцветные пятна, которые
и называются негативными пятнами
Дальбекко или бляшками. Каждая бляшка
соответствует островку мертвых клеток.
Бляшки в культуре клеток образуют многие
вирусы. При большой плотности
(соответствующей низким разведениям
вируса) они часто сливаются друг с
другом. Время появления и морфология
бляшек зависят от вида и штамма вируса,
типа клеток и условий культивирования.

АГ вирусов. По структуре они тримеры (из 3 мономеров), каждый мономер состоит из 2 цепей: легкой и тяжелой. Одним участком легкая часть погружена в липидный суперкапсид, а другой участок дисульфидными связями соединена с тяжелым участком. Наружный участок тяжелой цепи – эпитоп (специфичность) и этим же участком прикрепляет вирус к сиаловым рецепторам дыхательных путей. У легкой части есть участок, обеспечивающий слияние суперкапсида с мембраной клетки. У легкой цепи есть участок одинаковый для всех вирусов одной группы – консервированный участок. Наличие Н-АГ определяют РГА, а тип Н-АГ определяют РТГА (реакция торможения агглюцинации).

Непрямые (пассивные) реакции агглютинации Для данной реакции растворимые антигены или антитела адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, бентонит, активированный уголь и другие) или клетки, например, эритроциты (бараньи, О- группы человека). Пассивные реакции агглютинации по чувствительности намного превосходят прямую реакцию агглютинации. Если адсорбентом являются эритроциты, реакция носит название пассивной (непрямой) гемагглютинации – РПГА или (РНГА).    Реакцию обычно проводят с использованием пластмассовых пластин с лунками. Нагруженные (сенсибилизированные) эритроциты склеиваются в присутствии специфического искомого антигена или антитела и выпадают в осадок в виде гемагглютината в форме «зонтика». При отрицательной реакции сенсибилизированные эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки». При работе с растворимыми, мелкодисперсными антигенами применяют реакцию непрямой, или пассивной, гем-агглютинации (РПГА). Антиген предварительно адсорбируют на инертных монодисперсных частицах или клетках, например на эритроцитах, готовят эритроцитарный диагностикум. Такие нагруженные антигеном эритроциты склеиваются под действием иммунной сыворотки, содержащей антитела к данному антигену (РПГА).            Реакция отличается высокой чувствительностью и позволяет выявлять сравнительно небольшие концентрации антител в исследуемых сыворотках. При необходимости обнаружения антигена в исследуемом материале эритроциты предварительно нагружают специфическими антителами и также ставят РПГА. При помощи РПГА определяют полные (бивалентные) антитела. Неполные (моновалентные, блокирующие) антитела не выявляются этим методом, так как, соединяясь с антигеном, блокируют его, но не могут вызвать агрегации частиц в крупные конгломераты.

Реакция гемадсорбции — способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. « Цветная» реакция оценивается по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде культивирования. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе своего метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и соответственно цвета индикатора. При продукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный цвет.

Реакция торможения гемадсорбции (РТГадс). Принцип реакции базируется на явлении гемадсорбции. Оно заключается в том, что эритроциты приобретают способность адсорбироваться на поверхности культур клеток, которые испытали модификацию в результате появления в оболочке гликопротеинов вирусов. Антитела иммунной сыворотки при взаимодействии с поверхностными антигенами вирусов, представленными в оболочке, связывают их, вследствии чего тормозится адсорбция эритроцитов на клетках.

Компонентами реакции являются вирусы, способные к гемадсорбции, культура клеток, в которой они развиваются, противовирусная сыворотка с разведением 1:10 и больше, 0,4‑1,0 % завись эритроцитов петуха, гвинейской свинки или человека, трижды отмытая физраствором или раствором Хенкса. Специфические сыворотки, которые используют в опыте, предварительно обрабатывают ферментами, которые разрушают рецепторы, поддают температурному влиянию, чтобы освободить от неспецифических ингибиторов гемагглютинации. Реакцию ставят в пробирках или на специальных стеклянных пластинах, на которых есть монослой культуры клеток. Одно из преимуществ РТГадс заключается в том, что ее можно ставить к появлению цитопатического эффекта.

Практическая значимость использования реакций с метками (РИФ, ИФА, РИА и др.). Ингредиенты. Варианты постановки.

РИФ. Один из компонентов иммунной реакции, как правило АТ, метится (конъюгируется) флюоресцирующим красителем. Чаще всего для этого используют флюоресцеинизотиоционаты (ФИТЦ) – зеленое свечение в ультрафиолетовом свете и тетраметилродаминизотионат (ТРИТЦ) – оранжево -красное свечение. А Т, которые метят флюорохромом, должны обладать физико -химической гомогенностью. Наиболее подходящими для мечения являются моноклональные антитела. А Г (искомым или известным) для РИФ могут быть антигены, локализованные в клетке или на клетке, срезах тканей.

РИФ выявляют и идентифицируют:

4. микроорганизмы в чистых и смешанных культурах, в мазках — отпечатка;

5. клетки, пораженные вирусами и другими микроорганизмами;

6. Т и В лимфоциты, нормальные киллеры и другие клетки иммунной системы.

4. для изучения биосинтеза иммуноглобулинов в плазмоцитах, их транспорта из клеток, иммуноглобулиновых рецепторов В лимфоцитов

5. для выявления титра антител при серодиагностике

6. для выяснения закономерностей возникновения и развития злокачественных новообразо- ваний на клеточном и тканевом уровне и т.д.

Варианты постановки РИФ:

3. Прямая РИФ. Для каждого изучаемого АГ должна быть гомологичная иммунофлюоресцентная сыворотка

4. Непрямая РИФ (РНИФ) основана на использовании двух различных антисывороток. Вначале применяют немеченые АТ к искомому АГ (или искомые АТ в сыворотке человека к известному АГ). На 2-м этапе образовавшийся комплекс АГ-АТ обрабатывают антилюминесцентной сывороткой, содержащей меченые флюорохромом АТ к иммуноглобулинам того вида животных, чья сыворотка использовалась на 1 этапе реакции

5. Антикомплементарный метод РИФ (РИФСК) основан на способности комплемента (сыворотки морских свинок) фиксироваться на иммунном комплексе. В этом варианте используют люминесцентные сыворотки против глобулинов (комплемента) морской свинки

6. Р ГИФ (реакция гашения иммунофлюоресценции). Используется для выявления титра АТ в исследуемой сы- воротке, при наличии известного клеточного АГ и специфической к нему люминесцентной сыворотки. На первом этапе на известный АГ наносят исследуемую сыворотку, и если в ней есть соответствующие антигену антитела, они занимают эпитопы АГ. При добавлении на втором этапе люминесцентной сыворотки к данным АГ, присоединение люминесцентных АТ к эпитопам происходить не будет. Свечения не наблюдается.

ИФА. Особенностью метода ИФА является использование функционально активной биологической молекулы фермента. Комплекс конъюгированных иммунореагентов с ферментами (ф) проявляет функциональную активность, т. е. сохраняется высокая специфичность иммунореагентов и способность фермента расщеплять добавленный субстрат (с) с образованием легко обнаруживаемых продуктов. В связи с этим можно регистрировать и учитывать количественно взаимодействие иммунореагента, например АТ с гомологичным АГ. Вначале ИФА использовали в иммуногистохимии для выявления локализации тканевых и клеточных АГ, а затем были разработаны варианты реакции, которыми можно качестdенно и количественно выявить иммунореагенты в жидкостях.

5. Ферменты применяют только те, которые расщепляют субстрат с образованием продуктов легко (улавливаемых) определяемых: ПХ (пероксидаза хрена), ЩФ (щелочная фосфатаза), каталаза, уреаза, фосфолипаза и др. Ферменты, используемые в ИФА должны отвечать следующим требованиям: содержать в структуре определенные реакционные группы, по которым идет связывание с молекулой иммунореагента не меняя его специфичности; быть чистыми; сохранять ферментативную активность в конъюгированном с иммунореагентом виде. Субстрарами в зависимости от реагента используют: 5- аминосалициловую кислоту, ортофенилендиамин, пирогаллол и другие

6. Иммунореагенты. В настоящее время иммунореагентами, с которыми связыdают ферменты, могут быть АТ, АГ. Фермент присоединяют к иммунореагенту с помощью бифункциональных реагентов: глутарового альдегида, периодат натрия, фенилендималеимида и др. Эти соединения обладают химически активными группировками, которыми они ковалентно взаимодействуют с биомолекулами. Так, глутаровый альдегид реагирует преимущественно с E аминогруппами аминокислот, в частности лизина, периодат натрия с углеводными остатками.

Классификация и варианты ИФА Существует множество вариантов ИФА. Прежде всего ИФА включает две группы способов постановки реакции: твердофазный (гетерогенный) – ТИФА и гомогенный — ГИФА. Они в свою очередь подразделяются на различные модификации.

Гетерогенный (твердофазный) способ — твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА). При этом способе АГ или АТ предварительно адсорбируют на твердый носитель (сорбционно и ковалентно). В качестве твердой фазы используют различные микропористые (сефароза, стекло, биогель) и непористые носители (полистирол, полихлорвинил, нейлон, полистирен и другие). По физическому состоянию это могут быть гели, шарики, диски, титрационные панели.

Варианты ТИФА  Существуют неконкурентные и конкурентные варианты. При неконкурентных вариантах реакция АГ -АТ происходит на поверхности твердой фазы, ингредиенты добавляются последовательно и определяется количество метки, связавшейся с носителем. При этом количество связавшейся метки прямо пропорционально количеству искомого АТ или АГ в исследуемом образце. При конкурентных вариантах постановки реакции немеченый исследуемый образец и известное количество меченого искомого вносят в лунки, сенсибилизируют АГ или АТ одновременно, где происходит конкуренция между первым и вторым образцами за связывание с твердофазным иммуносорбентом. В этом случае    количество связанной с твердой фазой метки обратно пропорционально количеству    искомого образца.

Конкурентные методы. На первом этапе к ТФ прикрепляется АТ против искомого АГ. Затем вносят испытуемую пробу и известное количество АГ, меченого ферментом, который конкурирует за центры связывания антител (важ-ным является правильный подбор концентрации меченого АГ). Или на первом этапе к ТФ прикрепляется АГ к искомым АТ (например, в сыворотке больного). Затем вносят исследуемую сыворотку (АТ? к АГ) и известное количество коъюгирующей с ферментом иммунной сыворотки, т.е. сыворотку с АТхФ к данному АГ. Эти сыворотки конкурируют за связывание с эпитопами антигена.

ПРИМЕНЕНИЕ ИФА. Методы ИФА широко используются в различных областях биологии и медицины. Р ИА это методики, в которых наличие ИК определяется с помощью радиоактивной метки, предварительно введенной в состав антител или антигенов. Наиболее широко используют две разновидности РИА: радиоиммунопреципитация (РИП) и твердофазный радиоиммунологический анализ (ТФ РИА).

Методика РИП заключается в:

5. формировании в растворе радиоактивного иммунного комплекса (при предварительном введении в состав одного из участников реакции антиген -антитело радиоактивной метки),

6. отделении этого комплекса от не вошедших в него макромолекул

7. анализе его радиоактивного компонента.

Отделение ИК от макромолекул проводится с помощью различных физико -химических методик: электрофореза в геле, агарозе, адсорбцией на различных органических и неорганических поверхностях и т.д., но наиболее часто для отделения ИК используется метод «двойных антител», в котором комплекс антиген -антитело утяжеляется с помощью его взаимодействия с антивидовыми иммуноглобулинами, специфичными к антителам, вошедшим в ИК. После формирования вторичного ИК высокомолекулярный преципитат отделяют фильтрацией или центрифугированием. Далее проводят количественный и качественный анализ радиоактивного компонента преципитата. Р ИП можно проводить либо в прямом, либо в конкурентном варианте. Т Ф РИА заключается в формировании ИК не в растворе, а на твердой фазе, где предварительно иммобилизируют антиген или антитело. На иммобилизированный антиген (или антитело) последовательно сорбируются остальные компоненты ИК. Такая методика дает возможность удалять из смеси не вошедшие в ИК макромолекулы с помощью простой промывки. Наиболее простым вариантом ТФ РИА является прямой анализ, основанный на эффекте прямой адсорбции антигена на твердую фазу.

Для выявления (индикации) вирусов применяются следующие методы.

Индикация вирусов в культуре клеток осуществляется, прежде всего, по цитопатическому действию (ЦПД) вирусов, сроки и характер которого зависят от свойств вируса, проявляясь дегенеративными изменениями клеток с последующей их гибелью и отслаиванием от стекла (рис. 29).

Полная дегенерация клеток сопровождается значительными изменениями в виде пикноза ядра и цитоплазмы, отслаиванием клеточного монослоя от стекла.

Частичная дегенерация культур клеток может протекать по следующим типам:

— гроздеобразования (округление, увеличение и слияние клеток с образованием гроздевидных скоплений, типично для аденовирусов),

— очаговой деструкции (очаги пораженных клеток на фоне в целом сохранившегося монослоя), характерной для вирусов гриппа;

— симпластообразования (слияние клеток с образованием гигантских многоядерных клеток в виде симпластов или синцитиев, характерных для вирусов кори, паротита, парагриппа, респираторно-синцитиального, герпеса, иммунодефицита человека).

Пролиферативный тип ЦПД с трансформацией клеток в злокачественные, обладающие неограниченными потенциями к росту, способны вызывать онкогенные вирусы.

Сроки, в течение которых наступает ЦПД, вариабельны (например, 1-2 дня у полиовирусов, 7-14 суток у аденовирусов).

Если в инфицированных культурах клеток ЦПД отсутствует или слабо выражено, проводят «слепые пассажи», т.е. заражают культуральной жидкостью новые культуры клеток.

Рис. 29. Культура клеток почек обезьян (а – незараженная, б – цитопатическое действие вируса) х 200

Индикация вирусов с помощью реакции гемадсорбции (РГад).

Сущность этой реакции заключается в способности эритроцитов человека или животных адсорбироваться на поверхности клеток, инфицированных рядом вирусов (например, орто и парамиксовирусов и др.) в ранние сроки их репродукции (до развития ЦПД) в результате действия гемагглютининов – гликопротеидов, входящих в состав суперкапсида вируса. Для постановки РГад в культуру клеток добавляют 0,2 мл 0,5%-й взвеси эритроцитов, выдерживают 15-20 мин при температуре 40, 200 или 370 С в зависимости от свойств вируса, после чего взвесь эритроцитов удаляют и производят учет реакции под малым увеличе­нием микроскопа по скоплению эритроцитов на отдельных клетках или на всем монослое.

Индикация вирусов по цветной пробе.

Принцип метода основан на определении кислых продуктов метаболизма, накаливающихся в клетке в процессе ее жизнедеятельности с помощью индикатора фенолового красного, меняющего свой цвет с красного в щелочной среде на оранжево-желтый в кислой среде. При заражении культуры клеток вирусами, вызывающими ЦПД (например, аденовирусы, энтеровирусы и др.), ме­таболизм клеток подавляется, рН среды не меняется и она остается окрашенной в красный цвет.

Индикация вирусов по внутриклеточным включениям.

Репродукция некоторых вирусов (оспы, герпеса, бешенства) приводит к образованию внутриклеточных включений, локализующихся в ци­топлазме или в ядре клеток и представляющих собой скопления вируса (или его антигенов). Включения выявляют путем световой микроскопии культур клеток, окрашенных по Романовскому — Гимзе или другими методами, а также с помощью прямого флюорохромирования (например акридиновым оранжевым) с последующей микроскопией препаратов в люминесцентном микроскопе.

Индикация вирусов с помощью прямой РИФ – выявлениевирусных антигенов, находящихся в инфицированной клетке культуры ткани, с помощью антител диа­гностической иммунной сыворотки, специфических иммуноглобулинов или моноклональных анти­тел, меченых флюорохромом, обычно флюоресцеином (рис. 30).

Индикация вирусов с помощью электронно-микроскопического метода (ЭММ) применяется, в основном, в научных исследованиях. Материал для ЭММ концентрируют различными методами (ультрацентрифугирование, хроматография на колонках, адсорбцией с помощью специальных сор­бентов или антител – для метода иммунной электронной микроскопии). Э ММ позволяет обнаружить в ядре или цитоплазме клеток отдельные вирионы, а также их скопления. В практических целях ЭММ может быть полезен для индикации и идентификации вирусов с типичной морфоло­гией (оспенные вирусы, ротавирусы, коронавирусы, ВИЧ и т.д.).

Рис. 30. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – выявление вирус-специфических антигенов. х 900

Индикация вирусов по образованию бляшек — очагов разрушенных вирусом монослоя культуры клеток под ага­ровым покрытием. Количество бляшек отражает инфекционную активность вируса.

Для постановки этой пробы вирусную суспензию в разных разведениях вносят в культуры ткани, находящиеся в плоских сосудах, после чего монослой клеток заливают гелем (слой агара или бентонита с индикатором нейтральным красным). Время бляшкообразования для большинства вирусов, обладающих ЦПД, варьирует от 36 до 48 ч. Бляшки выглядят в виде неокрашенных светлых пятен на розово-красном фоне окрашенного монослоя. В бентонитовом методе монослой клеток молочного цвета, бляшки прозрачные.

Индикация вирусов в куриных эмбрионах.

Зараженные РКЭ инкубируют в термостате при 35- 370 С в течение 48 -72 ч., после чего производят их вскрытие, амниотическую и аллантоисную жидкость отсасывают шприцем, а оболочки и эмбрион извлекают и помещают в стерильные чашки Петри. При репродукции некоторых вирусов (натуральной оспы, осповакцины, простого герпеса) на ХАО кури­ных эмбрионах появляются характерные бляшки — беловатые пятна диаметром 1-2 мм, количество которых соответствует числу инфекционных ча­стиц.

В аллантоисной и амниотической жидкости зараженных эмбрионов ряд вирусов (например, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, аденовирусы и т.д.) может быть выявлен с помощью реакция гемагглютинации (РГА). Принцип реакции состоит в способности гемагглютининов — поверхностных вирусных структур гликопротеидной при­роды этих вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты опреде­ленных видов животных, птиц или человека. Р ГА не относится к иммунологи­ческим реакциям, поскольку в ее основе отсутствует взаимодействие АГ и AT.

РГА ставят обычно в пробирках или в специальных полистироловых план­шетах. Для этого гото­вят двукратные разведения вирусосодержащего материала на ФР в объеме 0,5 мл. Во все пробирки добав­ляют 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов. В контроле к 0,5 мл ФР добавляют аналогичный объем взвеси эритроцитов. Пробы учитывают через 30-60 мин инкубации при комнатной температуре, в термостате при 370 С или в холодильнике при 40 С. Положительная реакция характеризуется выпадением осадка эритроцитов в виде «зонтика» с фестончатыми краями; при отрицательном результате эритроциты оседают в виде компактного осадка («пуговки» — рис. 31).

Гемагглютинационный титр (макси­мальное разведение вирусосодержащей жидкости, вызывающее аг­глютинацию эритроцитов — одна гемагглютинирующая единица вируса,1 ГЕ) соответствует концентрации вируса. Агглютинацию эритроцитов могут вызывать также некоторые бактерии (стафилококки, эшерихии, сальмо­неллы, шигеллы, холерный вибрион Эль-Тор), что необходимо учитывать при трактовке результатов РГА при исследовании вирус-содержащего материала, загрязненного бактериальной микрофлорой.

Определение титра вирусов можно проводить также на хорионаллантоисной оболочке. Для этого в лунки стерильных полистироловых пластин помещают кусочки скорлупы 11-12-дневного куриного эмбриона с неповрежден­ной ХАО, добавляют вирусосодержащую жидкость в десятикратных разведениях на буфере, накрывают пластины фоль­гой и инкубируют при 35-37 0 С в течение 24-72 часов. После этого скорлупу удаляют, добавляют 0,5% взвесь куриных эритроцитов и производят учет реакции по эффекту гемагглютинации, который свидетельствует о репродукции вируса.


ВИРУСОЛОГИЯ

Рис. 31. Реакция гемагглютинации для выявления вируса гриппа в хорион-аллантоисной жидкости куриного эмбриона.

Индикация вирусов в организме лабораторных животных находится в зависимости от вируса и вида чувствительного лабораторного животного, будет описана в лабораторной диагностике конкретных вирусных инфекций.

Идентификация вирусов проводится с помощью следующих методов.

Учет вирусиндуцированных патологических изменений в чувстви­тельных живых системах.

Изучение антигенных свойств вирусов в серологических реакциях с противовирусными сыворотками является основным методом идентификации вирусов. Для этого используют ряд иммунологических реакций.

Реакция нейтрализации основана на способности антител нейтрализовать инфекционную активность вирусов в культурах ткани, РКЭ, чувствительных лабораторных животных. Из вирус-содержащего материала готовят десятикратные разведе­ния и добавляют к ним специфическую сыворотку в разведении в соответствии с титром, указанным на этикетке ампулы. Смеси вирус-сыворотка инкубируют 30 — 60 мин при 37 °С для обеспече­ния связывания антигенов с антителами, после чего смесью за­ражают культуру ткани, куриные эмбрионы или лабораторных животных. Контролем является чувствительная биосистема, заражен­ная вирусом без сыворотки.

Реакция считается положительной в случае нейтрализации ЦПД в культуре клеток, а также при отсутствии патологических изменений в куриных эмбрио­нах или в организме животных. По результатам РН высчитывается индекс нейтрализации (ИН — отношение титра вируса в контроле к титру вируса в опыте). При ИН менее 10 реакция расценивается как отрицательная, от 11 до 49 — сомнительная, от 50 и выше — положительная.

РН может быть поставлена в наиболее чувствительном варианте — подавления вирусного бляшкообразования под действием вирусспецифической антисыворотки. Для этого к вирус-содержащему материалу добавляют соответствующую искомому вирусу антисыворот­ку и после инкубации в термостате при 370 С течение 30-60 мин смесь вносят в культуру чувствительных клеток. Бляшкообразование выявляют в слое агара или бенто­нита. Идентичность вируса антителам сыворотки проявляется подавлением бляшкообразования.

Другим вариантом РН является цветная проба. Положительный результа­т пробы в случае соответствия вируса противовирусным антителам проявляется блокадой репродукции вируса, клетка при этом остается жизнеспособной, вырабатывая кислые продукты метаболизма, под влиянием которых цвет индикатора (фенолового красного) меняется с красного на желтый. Для постановки пробы в пробирки вносят по 0,25 мл рабочего разведения вируса и соответствую­щую антисыворотку.

Смесь выдерживают при комнатной температуре 30-60 мин, добавляют в каждую пробирку по 0,25 мл клеточной суспензии и закрывают их резиновыми пробками. Пробирки инкубируют в термостате при 370 С 6-8 дней, результаты реакции учитыва­ют по изменению цвета индикатора (красный цвет индикатора соответствует щелочному характеру рН — 7,4 указывая на репродукцию вируса и подавление метаболизма клеток; желтый цвет свидетельствует о кислом рН — ниже 7,2 в результате нейтрализации вируса антителами и активном метаболизме клеток с выработкой кислых продуктов обмена).

Реакция торможения гемаггяютинации (РТГА) является одним из вариантов РН и ос­нована на нейтрализации гемагглютинирующих свойств вирусов специфичес­кими антителами, что проявляется отсутствием агглютинации чувствительных эритроцитов с формированием на дне пробирки или лунки полистиролового планшета компактного осадка вместо «зонтика». Р ТГА используется как для определения антител в качестве метода серологической диагностики, так и для идентификации вирусов, обладающих гемагглютининами. Феномен РТГА проявляется в образова­нии компактного осадка эритроцитов вместо «зонтика» гемагглютинации.

Перед постановкой РТГА сыворотки обрабатывают периодатом калия, каолином, бентонитом, ацетоном или други­ми веществами для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации. После этого к двукратным разведениям сыворотки добавляют равное количество вируссодержащей жидкости с активностью 4 ГЕ, смесь инкубиру­ют 30-60 мин при оптимальной для данного вируса температуре (40, 200, 370 С), а затем добавляют равный объем 0,5-1,0% взвеси эритроцитов. Смесь снова инкубируют 30-45 мин и производят учет результатов реакции. Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, которое вызывает торможение гемагглютинации.

Реакция торможения гемадсорбции (РТГадс) ос­нована на нейтрализации эффекта адсорбции эритроцитов на по­верхности клеток, инфицированных вирусами, способными вызывать гемадсорбцию. Для постановки реакции по 0,2 мл специфической сыворотки, разведенной 1:5, вносят в пробирки, инкубируют 30-60 мин в термостате при оптимальной для данного вируса температуре, затем добавляют по 0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов. Контрольные пробы содержат неиммунную сыворотку и эритроциты. Пробирки снова инкубируют 20-30 мин, после чего производят учет реакции. Идентификация вируса основывается на признаке отсутствия адсорб­ции эритроцитов на клетках в присутствии иммунной сыворотки при наличии гемадсорбции в конт­рольных пробирках.

Для антигенной идентификации вирусов в клетках культу­р тканей используются также РПГ, РСК, РИФ, РОПГА ИФА, РИА со специфическими иммунными противовирусными сыво­ротками или моноклональными AT.

— выявление вирусной НК методами генодиагностики с помощью метода молекулярной гибридизации и ПЦР;

— электронно-микроскопическое изучение вирусов (см. выше).

4)Цветная проба.

Цветную пробу для
лабораторных исследований впервые
предложили Солк, Янгнер и Уорд в 1954 г.
Предпосылкой для разработки данного
метода явились наблюдения Эндерса,
Уэллера и Роббинса, которые отметили,
что в незаражен-ных тканевых культурах
под влиянием продуктов метаболизма рН
среды сдвигается вкислую сторону, что
улавливается попожелтению фенолрота,
добавленного в питательную среду. В то
же время жидкость в тканевых культурах,
зараженных вирусом, убивающим живые
клетки, сохраняла свой красный цвет.
Наиболее отчетливые результаты дают
вирусы с высокой скоростью размножения
при культивировании их на медленнорастущих
клетках. Это способ не не отличается
высокой достоверностью

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: